翟立翔产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化研究

2023-05-10 14:56:27

产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化研究

翟立翔1,李国丽1,冷艳1,李师翁1,2*,陈熙明2,陈拓2,刘光琇2

1(兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州,730070) 2(甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室/中国科学院西北生态环境资源研究院沙漠与沙漠化重点实验室,甘肃 兰州,730000)

  以实验室构建的产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了100 L发酵罐中高密度发酵工艺及产物分离纯化方法。研究了不同培养基、菌体密度、诱导物及其添加方式等对产物的影响。结果表明,用BSM培养基发酵培养至菌体密度达到190 g/L时开始添加乳糖诱导,乳糖添加量为5 kg,补料流加速度为1 L/h,诱导25 h,菌体细胞湿重达280 g/L,发酵液中蛋白产量达27.8 mg/L,抗菌肽PSI效价达到2.36×109 U/L。采用多种分离纯化方法对发酵液中抗菌肽PSI进行分离纯化,结果表明,阴离子交换色谱纯化效率最高,纯化后蛋白效价为8.83×109 U/L,其次为丙酮沉淀、超滤、硫酸铵分级沉淀,纯化后蛋白效价依次为6.35×109、4.56×109、3.28×109 U/L。

关键词 抗菌肽PSI;乳酸克鲁维酵母;基因工程菌;高密度发酵;分离纯化

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是一种能高效表达外源蛋白的酵母表达系统,作为美国FDA认证的食品安全级酵母[1],具有遗传稳定,蛋白可翻译后加工,产物可分泌到胞外,可高密度发酵且发酵过程无产气现象,不会发生爆罐、发酵过程中所需的诱导剂是乳糖或半乳糖,相对甲醇诱导更安全、表达产物可直接应用于食品及饲料工业中等优点[2],目前已经有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。

抗菌肽PSI是植物天冬氨酸蛋白酶的前体,其典型特征是分子内部有一个约由100个氨基酸残基构成的结构域,被称为植物特异插入片段[2],对植物病原真菌Verticillium dahlia具有较强的抗性,其作用机制是通过与磷脂膜泡相互作用,在一定pH下或者依附于脂质而诱发细胞内容物的裂解,从而杀死生物病原体,抑制真菌孢子的形成[3-4]

高密度发酵是提高基因工程菌外源蛋白表达量的有效策略。迄今为止,已有数千种蛋白通过高密度发酵得以大量表达,如人的C型溶菌酶LYZL6表达量高达331 mg/L[5], 植酸酶酶活达1.34×104 U/mL[6], 来自兔出血病病毒的衣壳蛋白表达量达16 mg/L[7], 麦角固醇表达量达1.5 g/L[8]等。但是,由于重组菌本身的局限性,如启动子特性、密码子使用频率或基因拷贝数等,或者是由于发酵工艺的不同,外源蛋白表达量差异很大。目前,针对乳酸克鲁维酵母高密度发酵,业界已经建立了技术相对成熟的补料分批发酵和连续发酵两种发酵方式[9],在实验室基础上,主要研究补料分批发酵工艺[10]的影响和调控。

发酵产物的分离、提取和纯化是发酵工业中重要的步骤,分离纯化技术的落后,会严重阻碍微生物工程产品的工业化进程,使实验室成果无法转化为生产力。本研究应用重组乳酸克鲁维酵母表达抗菌肽PSI,优化了发酵罐发酵工艺,并对发酵液中抗菌肽PSI的分离纯化方法进行了比较和分析,采用SDS-PAGE检测其纯化效果,为发酵法制备抗菌肽PSI过程中的分离纯化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

重组抗菌肽PSI乳酸克鲁维酵母基因工程菌PN21由本实验室构建并保存[11]

10~100 L双联发酵罐,江苏镇江东方生物工程设备技术有限责任公司;小型垂直蛋白电泳仪,美国Bio-Rad 公司;Q-SepharoseTM-XL,Amersham公司;UFC超滤管,Millipore公司;台式高速冷冻离心机,利康发展有限公司;化学试剂均为国产分析纯。

微量盐PTM(1L):CuSO4 6g、NaI 0.08g、MnSO4 3 g、Na2MoO4 0.2g、H3BO3 0.02g、CoCl2 0.5g、ZnCl2 20g、FeSO4 65g、Biotin 0.25g、H2SO4 5mL,过滤除菌。

YDFM培养基(1 L):(NH4)2SO410 g、葡萄糖30 g、精氨酸1 mmol、赖氨酸1 mmol、 KH2PO4 11.83 g、 K2HPO4 2.29 g、 MgSO4 1 g、CaCl2 0.33 g、NaCl 1 g、KCl 1 g、PTM 4.35mL。

YDFMY培养基(1 L):(NH4)2SO4 10 g、葡萄糖30 g、精氨酸1 mmol、赖氨酸1 mmol、 KH2PO4 11.83 g、 K2HPO42.29 g、 MgSO4 1 g、CaCl2 0.33 g、NaCl 1 g、KCl 1 g、PTM 4.35 mL,酵母提取物10g,胰蛋白胨20 g。

BSM培养基(1 L):85% H3PO4 0.387 mol/L、CaSO4 0.93 g、K2SO4 18.2 g、葡萄糖30 g、MgSO4 14.9 g、KOH 4.13 g、PTM 4.35 mL,氨水调pH至5.0。

BSMY培养基(1 L):85% H3PO4 0.387 mol/L、CaSO4 0.93 g、K2SO4 18.2 g、葡萄糖30 g、MgSO4 14.9 g、KOH 4.13 g、PTM 4.35 mL,酵母提取物10 g,胰蛋白胨20 g,氨水调至pH 5.0。

补料培养基:葡萄糖储液500 g/L和乳糖储液200 g/L分别于灭菌锅中121 ℃灭菌30 min,冷却后加入4.35 mL/L PTM。

PBS缓冲液(1 L,含0.2 g叠氮钠):NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.4 g、KH2PO4 0.24 g、NaN3 0.2 g,调至pH 7.4,过滤除菌。

1.2 实验方法

1.2.1 重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌PN21高密度发酵

首先对10 L种子罐和100 L发酵罐分别进行空消,然后在种子罐装入4 L YDFM培养基,发酵罐装入40 L BSM培养基,于121 ℃灭菌30 min,待培养基冷却到30 ℃后,将提前摇好的1 L种子液接入种子罐,温度30 ℃,搅拌速度500 r/min,通气量7.5 m3/h,生长24 h后接入已灭菌的100 L发酵罐中,温度30 ℃,pH 6.0,搅拌速度500 r/min,通气量75 m3/h,生长24 h后开始流加葡萄糖使菌体密度增加,当菌体湿重达到190 g/L时,开始流加乳糖诱导。诱导25 h后收获产品,检测抑菌活性并计算生物效价及蛋白产量。

1.2.2 抗菌肽生物效价及产量检测

发酵液经12 000 r/min离心2 min,0.22 μm滤膜过滤后,用打孔法做抑菌实验,每孔加入75 μL的抗菌肽测试样品溶液,每个样品3个重复。30 ℃培养2 d后,观察抑菌圈大小并测量抑菌圈直径,根据公式计算抗菌肽的生物效价。

生物效价/(U·L-1)=2x×1 000×16 700

x=(y-4)/2.1

式中:y抗菌圈抑菌直径,mm(取平均值);4为孔穴直径,mm;2.1为抗菌肽浓度与抑菌圈直径的比值常数。

蛋白产量/(mg·mL-1) = (1.45×A280-0.74×A260)×稀释倍数

式中:A280A260分别代表波长在280 nm和260 nm处的吸光值。

1.2.3 响应面法优化发酵条件

根据单因素试验结果,选取诱导前时间间隔、乳糖流加量以及乳糖流加速度3个因素作试验因素,以抗菌肽产量为响应值,采用Box-Behnken模型设计响应面试验[12],因素编码及各自变量水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.2.4 数据统计

采用Originpro 9.1和Design-Expert 8.0软件处理数据并进行统计分析。

1.2.5 发酵产物的分离纯化

超滤浓缩法:取50 mL离心(12 000 r/min,3 min)后的发酵液,依次用1、0.45、0.22 μm的滤膜抽滤,得到的上清液装入100 kDa的超滤管离心(6 000 r/min,30 min),将通过膜的液体再用30 kDa的超滤管超滤,后依次通过10 kDa和1 kDa超滤管超滤并浓缩。分别收集分子质量在30~100 kDa、10~30 kDa、1~10 kDa和小于1 kDa的液体检测抑菌活性。

丙酮沉淀法:取300 mL离心(12 000 r/min,3 min)后的发酵液,将上清液分成6份装入三角瓶中,按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶9的比例加入丙酮溶液,4 ℃静置 20 min,将上清液离心(4 ℃,12 000 r/min,2 min)后用旋转蒸发仪将丙酮回收,收集残留液体待检测。将沉淀复融于无菌水中,保存备用。

硫酸铵分级沉淀法:取200 mL发酵液离心(12 000 r/min,10 min),将上清液分4份装入已灭菌的三角瓶(250 mL)中。分别往4份上清液中加入硫酸铵固体,边加边搅拌至第1份硫酸铵终质量浓度为200 g/L,第2份终质量浓度为400 g/L,第3份终质量浓度为600 g/L,第4份终质量浓度为800 g/L,于4 ℃冰箱中静置12 h,后离心(4 000 r/min,15 min),弃上清保留沉淀。将沉淀溶于PBS中,充分溶解后装入透析袋,4 ℃冰箱透析12 h。将透析液离心(12 000 r/min,5 min),保存在干净的三角瓶中,检测抑菌活性。

Q-SepharoseTM-XL阴离子交换色谱法:按照说明书安装好阴离子交换柱,用去离子水洗净树脂。再用3倍柱体积pH 7.0,20 mmol/L的磷酸盐缓冲液洗1次柱子。取50 mL离心(12 000 r/min,10 min)后的发酵液,分别用1、0.45、0.22 μm的滤膜抽滤,将抽滤后的液体上阴离子交换柱,分管收集流出液,保存备用,待50 mL发酵液全部流出后,用3倍柱体积的磷酸盐缓冲液冲洗柱子,收集流出液保存,接着用提前配制好的0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的NaCl溶液依次洗脱柱子,分管保存洗脱液。每个浓度NaCl洗完后均需用3倍柱体积的磷酸盐缓冲液冲洗柱子。

1.2.6 SDS-PAGE检测

对有活性的上清液进行SDS-PAGE分析,分离胶质量浓度为100 g/L,浓缩胶质量浓度为50 g/L,上样量20 μL,考马斯亮蓝R250染色,对电泳结果用凝胶成像仪成像。SDS-PAGE分析方法见参考文献[13]。

2 结果与分析

2.1 重组抗菌肽PSI乳酸克鲁维酵母基因工程菌高密度发酵

工程菌株在100 L发酵罐中培养24 h后开始流加葡萄糖,使菌体密度增加,随着发酵时间的增加,菌体密度不断增大,当酵母生长进入稳定期时(菌体湿重达到190 g/L),开始流加乳糖诱导,诱导25 h后结束发酵,收获发酵液80 L,菌体湿重达280 g/L。在乳糖诱导时每5 h取样1次,第5 h时,发酵上清液中就可检测到抗菌肽PSI蛋白,随着诱导时间的增加蛋白表达量迅速增加(图1),经诱导表达25 h后,发酵液中抗菌肽效价达2.36×109 U/L,成功实现了100 L发酵罐高密度发酵生产抗菌肽。SDS-PAGE结果表明:随着诱导时间的增加,发酵液上清中蛋白表达量逐渐增加,到第25 h,表达产物量最多(图2)。

图1 细胞湿重曲线及PSI生物效价曲线
Fig.1 Curves of cell wet weight and activity of antimicrobial peptide

图2 发酵液上清蛋白含量SDS-PAGE 检测
Fig.2 SDS-PAGE for the targetprotein in the fermentation supernatant

2.2 不同发酵培养基对抗菌肽表达量的影响

为研究YDFM和BSM诱导培养基对PN21菌株分泌表达抗菌肽PSI的影响,将PN21菌株分别在YDFM和BSM两种盐培养基中发酵,发现BSM培养基发酵后得到的抗菌肽抑菌圈直径明显大于经YDFM培养基发酵所得肽的抑菌圈直径(图3)。在YDFMY和BSMY两种培养基中(即在原培养基中添加酵母提取物和胰蛋白栋),BSMY没有明显变化,而YDFMY中抗菌肽的表达量有所提高。YDFM、BSM、YDFMY和BSMY培养基中抗菌肽的效价分别为1.22×109、2.36×109、2.01×109和2.78×109 U/L,BSMY、BSM和YDFMY中表达量相差不大。结果表明,BSM诱导培养基更适于重组工程菌表达抗菌肽,且更为经济和高效。

图3 不同发酵培养基对抗菌肽PSI产量的影响
Fig.3 Effects of fermentation media on the production of antibacterial peptide PSI

2.3 葡萄糖添加量流加速度对菌体生长的影响

在菌体密度增长阶段,准确称量10 kg葡萄糖,配制成500 g/L的溶液共20 L,以一定的流加速度(0.5 L/h)补料流加,分别在加入5 L(2.5 kg)、7 L(3.5 kg)、10 L(5 kg)、15 L(7.5 kg)和20 L(10 kg)时取样检测细胞湿重。以一定的葡萄糖添加量(5 kg)补料流加,设置0.3、0.5、1 L/h三组不同流加速度,每组实验分别进行,待葡萄糖全部流加完后检测细胞湿重。每个实验重复2次,取平均值以确定酵母生长状况。结果表明,细胞湿重随葡萄糖的加入而迅速增加(图4),当葡萄糖量达到7.5 kg时细胞湿重达到最大值240 g/L,继续添加葡萄糖细胞湿重有所降低,这是由于发酵罐中葡萄糖积累,菌体密度过高,通气量不足所造成的。葡萄糖流加速度为0.5 L/h时,罐内的溶氧量能稳定在35%左右,当流加速度大于0.5 L/h,溶氧低于20%,由于供氧不足导致部分细胞无氧呼吸,影响抗菌肽的表达量。因此,单纯地增加葡萄糖并不能实现高密度发酵,培养基底物浓度要适当,过量的葡萄糖还会出现底物抑制现象[14]

图4 葡萄糖添加量对菌体生长的影响
Fig.4 Effects of glucose addition on the cell growth

2.4 乳糖或半乳糖诱导对抗菌肽产量的影响

半乳糖作为乳酸克鲁维酵母的诱导物,在诱导酵母表达抗菌肽时起至关重要的作用。但是考虑到发酵成本,半乳糖并不适合大量使用,为了确定乳糖是否可作为半乳糖的替代品,将一定量的乳糖和半乳糖分别作为诱导物诱导酵母表达抗菌肽PSI,在不同诱导物下发酵液中抗菌肽效价分别为2.36×109和3.28×109 U/L,从而确定乳糖也可作为诱导物诱导酵母表达抗菌肽。

2.5 诱导重组菌抗菌肽表达条件的优化

2.5.1 诱导前时间间隔对抗菌肽产量的影响

在添加诱导物之前,发酵罐中的葡萄糖是否消耗彻底,直接影响重组菌对外源蛋白的表达。实验设计了0、0.5、1、1.5和2 h五个诱导前时间间隔,在乳糖添加量和流加速度相同的情况下比较发酵结束后发酵液中抗菌肽效价。结果表明,随着诱导前时间间隔的延长,发酵液中抗菌肽的效价不断增大,1 h的时间间隔获得了最大1.22×109 U/L抗菌肽效价,说明发酵罐中的葡萄糖消耗彻底。当诱导前时间间隔延长至1.5 h后,抗菌肽的效价出现下降,表明当葡萄糖消耗完以后,部分酵母因缺乏营养进入休眠状态或出现死亡的现象,导致诱导率降低(图5)。因此,最佳诱导前时间间隔以1 h为宜。

图5 诱导前时间间隔对抗菌肽产量的影响
Fig.5 Effects of fermentation time before induction on activity of antimicrobial peptide

2.5.2 乳糖添加量、流加速度对抗菌肽产量的影响

在诱导阶段,准确称量6 kg乳糖,配制成200 g/L的溶液共30 L,以一定的流加速度(1 L/h)补料流加,分别在流入15 L(3 kg)、20 L(4 kg)、25 L(5 kg)、30 L(6 kg)时取样检测抗菌肽的生物效价。以一定的乳糖添加量(5 kg)补料流加,设置0.5、1、1.5和2 L/h四组不同流加速度,每组实验分别进行,待乳糖全部流加完后检测抗菌肽的生物效价,每个实验重复2次。结果表明,随着乳糖添加量和流加速度的增加,发酵液中抗菌肽的效价不断增大,当乳糖添加量大于25 L时,抗菌肽的效价有所下降(图6-a),原因可能是随着代谢产物的积累,产生的降解酶使抗菌肽降解所致[15]。说明25 L乳糖能诱导表达肽的量达到最大化。当乳糖流加速度为1 L/h时,发酵液中抗菌肽的效价达到最大,乳糖流加速度大于1 L/h发酵液中抗菌肽的效价反而有下降(图6-b),主要原因是在提高流加速度条件下,导致发酵罐内乳糖积累,溶氧急剧下降,细胞表达抗菌肽受到抑制且会进行无氧呼吸,进而使肽产量下降。因此,乳糖添加量为25 L且流加速度为1 L/h时,酵母表达抗菌肽的量最高。

图6 乳糖添加量、流加速度对抗菌肽产量的影响
Fig.6 Effects of lactose addition and flow acceleration on production of antimicrobial peptide

2.6 重组菌抗菌肽表达条件的响应面法优化

2.6.1 响应面试验设计与结果分析

在进行响应面设计时,以诱导前时间间隔(A)、乳糖流加量(B)以及乳糖流速(C)作为自变量,以抑菌圈直径为响应值(Y),共17个试验点,其中12个为析因点,5 个为中心点,中心点重复的目的是估计整个试验的纯试验误差。各因素对诱导抗菌肽PSI表达量的响应面试验设计方案与结果见表2。

2.6.2 模型的建立与显著性分析

利用Design-Expert 8.0软件对表2试验数据进行多元回归拟合,得到抗菌肽PSI抑菌活性的二次多元回归方程:Y=2.53+0.23A-0.056B+0.087C+0.037AB+0.20AC-0.10BC-0.92A2-0.40B2-0.43C2

表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Experiment design and result forresponse surface analysis

由方差分析得出表3的结果,从p值可以看出,模型极显著(p<0.01),说明回归方程可以很好地描述各因素与响应值之间的真实关系,失拟项 p=0.357 8>0.05不显著,表明试验结果与数学模型拟合程度良好,可用该模型来分析和预测抗菌肽PSI的发酵工艺条件,相关系数R2=0.987 6,表明98.76%的数据可用此方程解释。预测值与实测值之间有较好的相关性。回归方程中各变量对响应值影响的显著性,由F检验法判定,概率p值越小,则相应变量的显著性程度越高。

表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model

注:p<0.05);**.差异极显著(p<0.01)。

从回归方程系数显著性检验可知,一次项诱导时间间隔(A),二次项诱导时间间隔(A2)、乳糖流加量(B2)、乳糖流加速度(C2)及诱导时间间隔和乳糖流加速度的交互项(AC)对抗菌肽PSI表达量影响极显著(p<0.01),一次项乳糖流加速度(C)对抗菌肽PSI表达量影响显著(0.01<p<0.05),其他项影响不显著。各因素大小排序依次是诱导时间间隔(A)、乳糖流加速度(C)、乳糖流加量(B)。因此,各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,简单的分析方法难以解析,而响应面法能较好地描述它们之间的关系,并能较好地优化抗菌肽PSI的发酵工艺。

2.6.3 响应面交互作用分析

由图7、图8、图9响应面立体图和等高线图形可知:诱导前时间间隔与乳糖添加量、诱导前时间间隔和乳糖流加速度的交互作用对抗菌肽的产量影响均显著;图9-b中等高线图形趋于圆形,表明乳糖添加量与流加速度两因素交互作用不显著。

图7-a响应面图随着诱导前时间间隔的增加,抗菌肽的产量先增后减,且变化幅度较大;随着乳糖添加量的增加,抗菌肽的产量先增后减,变化幅度较小。这主要由于诱导前时间间隔较小时,发酵罐内的葡萄糖没有完全消耗,酵母会优先利用葡萄糖繁殖而不会产肽;随着诱导前时间间隔的延长,发酵罐中的葡萄糖被消耗,在只有乳糖存在的条件下,酵母诱导启动子打开,才能诱导表达抗菌肽;诱导前时间间隔过长时,发酵罐中的葡萄糖消耗完后培养基中缺乏营养,酵母相互竞争出现衰亡的现象,因而抗菌肽产量也较低。

图7 诱导前时间间隔和乳糖添加量对抗菌肽产量的响应面和等高线
Fig.7 Curvedsurface of response and contour lines of time interval before induction and lactose addition to production of antimicrobial peptide

图8-a可以看出,抗菌肽产量均随诱导前时间间隔和乳糖流加速度的增加,先增大再降低。抗菌肽产量随乳糖流加速度的变化是由于,起初流速较小时,不足以诱导所有酵母表达,随着流速增大,乳糖量充足,所有酵母表达量达最佳状态;继续加大流速,酵母来不及利用的部分乳糖在罐内积累,使得罐内溶氧急剧下降,当溶氧量低于20%时,酵母进行无氧呼吸,停止表达抗菌肽,因而抗菌肽产量也较低。

图8 诱导前时间间隔和乳糖流加速度对抗菌肽产量的响应面和等高线
Fig.8 Curvedsurface of response and Contour lines of time interval before induction and lactose flow acceleration to production of antimicrobial peptide

图9 乳糖添加量和流加速度对抗菌肽产量的响应面和等高线
Fig.9 Curvedsurface of response and Contour lines of lactose addition and flow acceleration to production of antimicrobial peptide

2.6.4 最优工艺条件及验证实验

由各响应面立体图可看出,响应值存在最大值。通过Design-Expert 8.0 软件对试验模型进行分析计算得出理论最佳发酵工艺:诱导前时间间隔1.14 h、乳糖流加量4.92 kg、乳糖流加速度1.07 L/h,模型预测的抗菌肽PSI生物效价的极大值为1.45×1010 U/L。在此条件下进行2次重复验证实验,抗菌肽PSI表达量1.04×1010 U/L,与理论预测值接近,说明该方程与实际情况的拟合性良好。因此,采用响应面分析法优化得到的工艺优化条件可行,参数准确可靠,具有实用价值。

2.7 发酵液中抗菌肽PSI的分离纯化

硫酸铵沉淀实验结果表明,当硫酸铵浓度为60%和80%时,发酵液沉淀中的抗菌肽PSI抑菌活性较强(图10-A),说明当硫酸铵浓度大于60%时,抗菌肽完全沉淀。阴离子柱分离结果表明,当用不同浓度的NaCl溶液对结合到阴离子柱上的抗菌肽PSI进行洗脱,盐浓度为0.2 mmol/L和0.4 mmol/L洗脱后抑菌效果较好(图10-B)。超滤纯化结果表明,当截留的蛋白分子量在10~30 kDa和30~100 kDa时抑菌效果最强,该结果与前人对乳酸克鲁维酵母表达抗菌肽PSI的研究结果相符,在截留蛋白分子量为30~100 kDa处出现抑菌效果是抗菌肽糖基化后的结果[16],有待进一步研究。分子量小于1 kDa时完全没有抑菌活性(图10-C)。丙酮沉淀纯化结果表明,当发酵液与丙酮比为1∶8和1∶9时,重溶于水的沉淀具有抑菌活性而上清液中无抑菌效果,说明发酵液与丙酮比大于1∶8抗菌肽被完全沉淀(图10-D)。SDS-PAGE分析表明,4种不同的分离纯化方法均在蛋白分子量为17 kDa处出现了明显的条带,与发酵液相比,阴离子柱和丙酮沉淀两种方法能够去除大部分杂蛋白,纯化效果较好(图11泳道2,5),其次是超滤法,在截留蛋白分子量为10~30 kDa处出现了如图11泳道4的结果,超滤最主要的目的是去除小分子物质并将样品浓缩,硫酸铵分级沉淀法纯化后,除了目的蛋白外,依然存在明显的杂蛋白(图11泳道3)。因此,这些方法均能在不同程度上将抗菌肽PSI提纯。

图10 不同纯化方法抑菌活性检测
Fig.10 Purificationof antimicrobial peptides PSI

1-发酵液;2-阴离子柱;3-硫酸铵分级沉淀;4-超滤浓缩;5-丙酮沉淀
图11 抗菌肽PSI纯化检测
Fig.11 Detection of purified antimicrobial peptides PSI

3 结论与讨论

抗菌肽PSI作为一种霉菌抑制剂,对多种霉菌具有一定的拮抗作用,尤其是对一些易使水果和食物变质发霉的真菌具有很好的抗性,抗菌肽PSI有望成为一种新型防腐剂。高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,乳酸克鲁维酵母高密度发酵表达外源蛋白是工业化生产重组蛋白的重要途径,目前已有多种重组蛋白通过乳酸克鲁维酵母高密度发酵。酵母工程菌株的发酵主要分为3个阶段: 第1阶段,在基础培养基中生长;第2阶段,流加葡萄糖阶段,此阶段菌体密度迅速增长;第3阶段,使用乳糖作为碳源进行诱导表达,此时蛋白开始大量表达,耗氧量迅速增加。

本研究在成功将抗菌肽PSI基因重组至乳酸克鲁维酵母中并建立基因工程菌的基础上,实现了重组抗菌肽PSI基因在乳酸克鲁维酵母中高效表达。经发酵工艺优化后,在10~100 L双联半自动发酵罐中,菌体细胞湿重达到280 g/L,诱导25h后抗菌肽效价达到2.36×109 U/L,蛋白产量达27.8 mg/L,并且通过SDS-PAGE 验证目的蛋白正确表达。CURTO等人[2]用乳酸克鲁维酵母分泌表达抗菌肽PSI,产量为4 mg/L。相比前人的发酵方法,本研究通过发酵罐发酵抗菌肽,发酵液上清中抗菌肽的产量大约提高到前人报道的7倍。对比分析表明利用发酵罐发酵能够提高抗菌肽产量的原因是:发酵过程可以人为控制溶氧、pH及诱导过程,避免了摇瓶发酵通气量不足、酵母自身代谢产酸对肽造成降解以及诱导物浓度不定等问题,发酵罐发酵可以保证酵母的整个生长和代谢过程均处于最佳的状态,从而使蛋白产量达到最大化。

SDS-PAGE 的结果表明在蛋白分子量为17 kDa和100 kDa左右处发现特异性的蛋白条带随着诱导时间的延长逐渐增加。该结果与前人对乳酸克鲁维酵母表达抗菌肽的研究结果相符,所以推测这条100 kDa的特异蛋白条带为糖基化后的抗菌肽PSI[16]。前人对抗菌肽进行直接提纯研究,发现这些抗菌肽具有非常高的比活且具有高分子量的糖基化修饰[2,17]。这也表明高分子量糖基化修饰是影响高效率表达抗菌肽PSI的关键。

对于生物大分子的分离,只使用单一的方法很难将待分离物质完全分离,通常将几种原理不同的技术组合起来以获得理想的纯化效果[18]。其中超滤浓缩去除了部分小分子杂质及色素,成本低,可处理大量样品;阴离子交换色谱可有效的去除大量色素及杂蛋白,具有载量大、分辨率好、流速高等优点。

本研究实现了抗菌肽PSI在发酵罐中的高效表达,并且讨论了不同纯化方法对抗菌肽提纯的效率,通过对抗菌肽PSI在100 L发酵罐中发酵成功,离将来果蔬保鲜以及植物防止病原菌入侵方面的应用又更近了一步,然而要将其开发成为新一代的食品防腐剂,还需对其生物学活性和毒性特征进行进一步的考察和确定。

High density fermentation of recombinant Kluyveromyces lactis producingantimicrobial peptide PSI and purification of itsproducts

ZHAI Li-xiang1, LI Guo-li1, LENG Yan1,LI Shi-weng1,2, CHEN Xi-ming2, CHEN Tuo2, LIU Guang-xiu2

1 (School of Chemical and Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China) 2 (Key Laboratory of Extreme Environmental Microbial Resources and Engineering, Northwest Institute of Eco-Environment and Resource, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACT A high density fermentation technology for the production of antimicrobial peptide PSI in a 100 L fermentor using a recombinant Kluyveromyces lactis strain was reported in this paper. The effects of mediums, cell density, as well as the inducer lactose and its fed-batch models, on the production of PSI were investigated. Results showed that 5 kg inducer lactose should be added with feeding velocity of 1 L/h when the cell density reach 190 g/L during the fermentation using BSM medium. After 25 h of induction culture, the cell wet weight, the protein yield, and the titer of PSI reached 280 g/L, 27.8 mg/L, and 2.36×109 U/L, respectively. The separation and purification of the PSI in the fermentation broth were also investigated. The purification efficiency of anion exchange chromatography, ultrafiltration, precipitation of ammonium sulphate or acetone were 8.83×109, 6.35×109, 4.56×109, and 3.28×109 U/L, respectively, which indicated that the most efficient technique for purification of PSI was anion exchange chromatography.

Key words antimicrobial peptide PSI; Kluyveromyces lactis; recombinant bacteria; high cell density cultivation; purification

第一作者:硕士 (李师翁教授为通讯作者,E-mail:lishweng@mail.lzjtu.com)。

基金项目:国家自然科学基金(31400437);国家自然科学基金(31560121)

收稿日期:2017-09-26;改回日期:2017-10-17

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015872

引用格式翟立翔,李国丽,冷艳,等.产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化研究[J].食品与发酵工业,2018,44(4):13-21.

ZHAI Li-xiang, LI Guo-li, LENG Yan,et al.High density fermentation of recombinant Kluyveromyces Lactis producing antimicrobial peptide PSI and purification of its products[J].Food and Fermentation Industries,2018,44(4):13-21.

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