1 材料与方法
1.1 材料与试剂
仔猪盲肠内容物10份，取自3个猪场；大肠杆菌K88（E. coli K88）、金黄色葡萄球菌ATCC 25923（S.aureus ATCC25923），梭菌增值培养基（RCM培养基）、梭菌选择性培养基（TSN培养基）、LB培养基，国产分析纯；细菌生化微量反应管、药敏纸片；细菌DNA提取试剂盒；猪胆盐，胰蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶，人工胃液、人工肠液根据中国药典进行配制；蛋白酶测定试剂盒、淀粉酶测定试剂盒、脂肪酶测定试剂盒。
1.2 实验方法
1.2.1 分离培养方法
采用厌氧培养箱来进行厌氧菌的液体培养、分离和稀释平板计数。取盲肠内容物10 g加到90 m L PBS中，放入80℃水浴10 min以杀死非芽孢菌，放入RCM培养基，于37℃厌氧培养36 h；将样品分别稀释到10-3、10-5、10-7，涂布于TSN培养基，37℃厌氧培养48 h；采用影印平板法分离菌种，选取严格厌氧生长的菌株，进行镜检；根据丁酸梭菌的培养特性、菌落形态和显微形态等特征，挑选符合特性的菌株进行生理生化鉴定和16S r DNA序列分析。
1.2.2 产抑菌蛋白的丁酸梭菌筛选
发酵上清菌液：分离的菌株在RCM液体培养基中厌氧培养24 h作为种子液；种子液按1%接种于新的RCM液体培养基中，37℃静置培养24 h作为发酵液。以8000 r/min，4℃离心10 min，取上清液备用。指示菌的制备：LB培养基培养。种子液按1%接种于LB液体培养基中37℃，200 r/min摇床过夜，稀释到107CFU/m L备用。抑菌试验初筛：采用孔穴琼脂扩散法。接种E.coli K88 和 S.aureus ATCC25923 至LB培养基，培养过夜后转接1%至5 m L体积LB培养基中培养（200 r/min，37℃）至 OD600=0.6 左右；灭菌后的 250 m L LB 固体培养基冷却至45~50℃时加入1‰的上述菌液，混匀后倒板；凝固后，用打孔器（孔径5 mm）在平板上打孔，分别加入50 μL发酵上清菌液，阴性对照加入等体积的RCM培养基，3个重复/样，置于37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。
抑菌试验复筛：发酵液和指示菌液体制备同上。
检测各发酵液的pH值，对上清液进行排酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理，孔穴琼脂扩散法测定其抑菌活性。
1.2.3 丁酸梭菌的鉴定
形态学鉴定：将目标菌株涂板于RCM培养基平板，37℃培养24 h，观察菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色镜检。生理生化鉴定：运用细菌微量生化反应管对菌株进行生理生化特征分析。16Sr DNA基因序列分析鉴定：细菌总DNA提取采用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取。PCR引物序列：7F：5′ -CAGAGTTTGATCCTGGCT -3′、1540R：5′AG－GAGGTGATCCAGCCGCA - 3′ ；反应体系（25μL）：5×Buffer（with Mg2+）2.5μL；d NTP（各2.5 mmol/L）1μL ；7F（10μmol/L）0.5μL；1540R（10μmol/L）0.5μL；基因组DNA（50 ng/μL）0.5μL；Ta Ka Ra Ex Taq 酶（5 U/μL）0.3μL；加双蒸水至25μL。PCR扩增程序：98℃ 预变性3 min，98℃变性25 s，55℃退火25 s，72℃延伸1 min，进行30循环，最后72℃延伸4 min。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段为1500 bp左右的阳性产物经纯化后送上海生工序列测定。运用NCBI上的BLAST将测得的基因序列和Gen Bank数据库进行同源性比较；
2 结 果
2.1 丁酸梭菌分离与筛选
2.1.1 丁酸梭菌的分离
从样品中分离出21株严格厌氧的革兰氏阳性细菌。根据细菌的菌落形态、细菌形态及严格厌氧特性能鉴定到属，经鉴定，12株菌株符合梭菌属细菌特性。根据梭菌属内的菌株进行芽孢位置染色实验和明胶液化实验可以鉴定到群，在群内只需进行蜜二糖、松三糖和淀粉利用实验，即可鉴定到种。分离到的12株梭菌进行芽孢染色实验、明胶液化实验和糖发酵实验。结果如表1所示，根据结果判定菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3、ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2为丁酸梭菌。
2.1.2 产抑菌蛋白的丁酸梭菌筛选
对筛选到的6株丁酸梭菌，使用孔穴琼脂扩散法进行发酵上清液的抑菌活性实验。发酵上清液经过酸排、H2O2酶、和蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K）处理后与上清液原液相比，抑菌活性结果如图1、表2、表3所示。各菌株发酵液p H较低，酸排除处理后，ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2菌株的发酵上清液抑菌活性消失，但pH4.5的乙酸、丁酸溶液对照并无抑菌活性。H2O2酶处理后抑菌活性并无显著差异，胰蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌活性则消失，说明起抑菌作用的物质是蛋白质。菌株ZJU-F1 、ZJU-F2、ZJU-K3的发酵上清液对
E. coliK88和S.aureus ATCC25923均具有抑菌活性。选择菌液抑菌活性最强的ZJU-F1菌株作为目标菌株进行下一步实验。
2.2 丁酸梭菌ZJU-F1的鉴定
2.2.1 形态学鉴定
丁酸梭菌ZJU -F1菌株在RCM固体平板培养12 h后，形态如图2-A所示，菌落呈奶油色圆形菌落，边缘整齐、不十分规则、稍突、表面湿润光滑，不透明，有酸臭味。挑取单菌落进行革兰氏染色，如图2-B所示，细菌直径为（0.6~1.2）×（3.0~7.0）μm，端圆，中间部分轻度膨胀，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，孢子卵圆、次端生，红色箭头为芽孢。
2.2.2 生理生化鉴定
丁酸梭菌 ZJU -F1 的生理生化试验和对不同碳源发酵利用情况试验结果如表4所示对照《伯杰氏细菌鉴定手册》检索，初步鉴定结果为丁酸梭菌。2.2.3 16Sr DNA 序列同源性分析 以菌株丁酸梭菌ZJU-F1的DNA为模板，16S r DNA通用引物进行扩增后得到约1500 bp的特异性扩增产物。经同源性比对，菌株与C.butyricum的同源性达100%，属于梭菌属群1 丁酸梭菌种。
2.3.3 丁酸梭菌分泌消化酶活性实验
如表8所示，丁酸梭菌ZJU-F1能分泌淀粉酶和蛋白酶，不产生脂肪酶。当该菌株在动物肠道存活繁殖时，就可能分泌淀粉酶和蛋白酶来辅助消化，提高饲料的消化率和动物生长性能。
2.3.4 丁酸梭菌分泌有机酸实验
丁酸梭菌 ZJU -F1分泌的有机酸结果如表 9所示，当丁酸梭菌在动物肠道存活繁殖时，丁酸梭菌能分泌丁酸、乙酸等有机酸到周围环境中，降低动物肠道pH值同时丁酸是动物肠道上皮细胞的能量物质，能增强动物肠道屏障功能。
3 讨 论
3.1 产抑菌蛋白的丁酸梭菌分离、筛选和鉴定
丁酸梭菌，根据其产芽孢的特性，对样品进行热处理以杀死非芽孢菌，涂布TSN
培养基平板后初步得到纯菌株，再通过影印厌氧和好氧培养，得到严格厌氧菌。接着对所得到的菌株进行明胶液化实验、芽孢位置染色实验和糖醇发酵实验鉴定到丁酸梭菌种。抑菌试验常用方法包括孔穴琼脂扩散法、牛津杯法、滤纸片法和浊度法等，琼脂扩散法具有操作便捷结果验证有效且更加直观等优点被广泛使用。菌液的抑菌活性则是通过其发酵过程中产生各种代谢产物包括酸性物质（有机酸）、过氧化氢酶和抑菌蛋白等来实现的。本试验采用孔穴琼脂扩散法对E.coli K88和S.aureus ATCC25923的抑菌效果表明，抑菌圈直径小于6 mm时抑菌活性较低，且发酵上清液对不同指示菌的抑菌效果并不相同。为了得到产抑菌蛋白的丁酸梭菌，排除丁酸菌在发酵过程中代谢产物对结果的影响，本试验采用酸排除、H2O2
排除等消除干扰因素。利用H2O2酶处理发酵上清后发现抑菌活性无明显影响，而调整pH至5.5后抑菌活性有所减弱，说明pH对抑菌活性有影响，而pH=4.5
的乙酸、丁酸的培养基对照并无抑菌活性，说明抑菌活性并非由于酸性物质所致，但低pH环境可以增强其他抑菌物质的抑菌活性。发酵上清经胰蛋白酶、蛋白酶
K处理后抑菌活性消失，说明发酵液中抑菌活性为蛋白质，可以初步确定其为细
菌素，且该细菌素可被蛋白酶降解而不在体内残留，具有较高的安全性。传统的菌落和细菌形态学、生理生化鉴定分析方法不能准确的鉴定出细菌的种属。16S r DNA序列是编码核糖体RNA小亚基16S r RNA的基因，具有高度保守的特性。16S r DNA技术则是通过对遗传特征的保守性序列分析，能够判断出细菌间亲缘关系的远近，从而准确的鉴定细菌的种属，该方法因其准确、快速、灵敏等优点已成为细菌鉴定有力手段之一。本研究通过严格厌氧条件下产芽孢确定其为梭菌属
细菌，并通过芽孢位置实验、明胶液化、糖发酵实验定到种，最后通过16S r DNA序列分析技术鉴定。
4 结 论
本研究仔猪盲肠内容物中分离到6株丁酸梭菌，通过多重抑菌实验对菌株进行初筛和复筛，得到产高活性抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。对目标菌株进行形态学、生理生化和16S r DNA基因序列同源性分析，鉴定结果为丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具较强的抗逆性和益生功能，作为饲料益生菌制剂具有很大的应用潜力。