测试原理:样品在浓盐酸溶液中水解, 释放出羟脯氨酸, 经氯胺T氧化, 羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物, 测波长560 nm处的吸光度。
具体操作步骤:
1. 配制6M盐酸溶液:取50 mL超纯水加入到100 mL的蓝盖瓶中,加入50 mL的浓盐酸(12 mol/L);
注:只能将酸加入水中,不能反过来。
2. 配制pH=6的柠檬酸盐缓冲液:称7.65 g的柠檬酸钠、7.24 g的乙酸钠溶解于100 mL超纯水,用醋酸调节pH=6;
3. 配制0.05 mol/L的氯胺T溶液:称0.141g氯胺T加入2 mL超纯水,3 mL2-甲氧基乙醇,5 mL柠檬酸盐缓冲液(现配现用);
4. 配制3.15 mol/L的高氯酸溶液:取5.4 mL70%的高氯酸,用超纯水定容到20 mL;
5. 配制10%的对二甲基氨基苯甲醛溶液(现配现用):称2 g的对二甲基氨基苯甲醛用2-甲氧基乙醇定容到20 mL(可用60 oC的水浴溶解);
6. 配制4-羟基-L-脯氨酸标准溶液:用超纯水制备1 mg/mL的4-羟基-L-脯氨酸母液,逐级稀释(上限200 μg/mL);
7. 取5 mL 6M 的浓盐酸加入25 mL的压力瓶中,每个瓶中加入500 uL的样品,氩气除氧,再加2 mL食用油液封;
8. 115oC煮4个小时,把油去除干净,转移到干燥器中,氩气保护,让浓盐酸充分把胶原分解成羟脯氨酸(过夜);
9. 第二天把水相层转到另一个瓶子中,放于热水浴中,放3-4小时让盐酸蒸发,重新用4 ml的超纯水溶解样品;
10. 取1 mL的样品到一个15 mL的离心管里面;
11:显色过程:0.5 mL的氯氨T 室温30 min;0.5 mL的3.15 M 高氯酸溶液室温10 min;0.5 mL的10% 对二甲基氨基苯甲醛溶液60°C 40min,560nm显色。