CRISPR/Cas9基因编辑技术的腾空出世，彻底改变了生物学领域，也成为许多实验室的必备技能。该技术既可以实现基因敲除（knockout），也可以用于基因敲入（knockin）。
在knockin时，需要一段DNA序列，以便产生特定的突变或插入新元件，该段DNA序列既可以是单链（ssDNA），也可以是双链的质粒（dsDNA）。
那么到底是使用单链还是双链的DNA序列呢？
如果只是引入较小的修饰，如单点突变或50 bp以下的突变，那么单链DNA就是个很好的选择。
如果想要插入较大的片段，比如荧光蛋白或表达框，那么就需要较长的DNA供体。这个供体可以是双链DNA，也可以是单链DNA。
双链的DNA细胞毒性大，定点敲入的效率低。
单链的DNA毒性低，定点敲入的效率显著高于双链的敲入效率，但长单链DNA合成非常昂贵，且容易出错。
下面一鸣同学就给胖友们介绍几种长单链DNA的合成方法。
原理：先将DNA转录成RNA，然后将RNA逆转录成cDNA，再用RNase H降解DNA：RNA中的RNA，形成单链的DNA。
ivTRT法示意图
需要的试剂盒：
体外转录试剂盒 (Promega, cat. P1320)
RNA纯化试剂盒(Ambion- Life Technologies, cat. AM1908)
逆转录试剂盒 (New England Biolabs, cat. M0253S；Life Technologies, cat. 18080051；Life Technologies, cat. 18090010)
DNA纯化试剂盒 (Promega, cat.A9282；MACHEREY-NAGEL,cat. 740609)
RNaseH (New EnglandBiolabs, cat. M0253S)
小结：该方法步骤繁多，操作复杂。由于RNA极易降解，因此操作过程中要求十分严格，该方法可以制备2000bp以内的ssDNA。
推荐指数：★★
Nicking切口酶法是宝柏公司开发的一种合成单长链的DNA的方法，该方法通过简单的操作，便可获得含有目的序列的高纯度长链ssDNA。
Nicking切口酶法示意图
操作步骤：
1. 使用Long ssDNA Preparation Kit 制备1500 base和3000 base的长链ssDNA；
2.将目的dsDNA片段(1500 bp或者3000bp)在pLSODN -1或pLSODN-3的MCS（Nt.BspQI位点与Nb.BsrDI位点之间）克隆后，使用切口酶（Nt.BspQI和Nb.BsrDI）对其处理，在目的片段的两端出现切口；
3.变性后，样品经琼脂糖凝胶电泳分离，从目的条带提取DNA，纯化。将所有的样品通过变性凝胶上样缓冲液进行变性后，再进行电泳；
4. 切出跑在前端的带，纯化后得到目的ssDNA。
特点：
▼不含有变异或末端缺失，可制备1,500base或者最长到3,000 base的长链ssDNA。
▼全程操作与普通的dsDNA片段制备法相同，无需准备特殊的机器以及试剂。
▼通过附加的DenaturingGel-loading Buffer（变性凝胶上样缓冲液）进行变性，可以使用琼脂糖凝胶电泳对目的长链ssDNA进行分离纯化。
小结：该方法可以制备3000 bp以内的ssDNA，操作也比较简单。
推荐指数：★★★
Strandase法是Takara旗下的Clontech推出的Guide-itLong ssDNA Strandase Kit （Cat. 632645），可制备长达5 kb的单链DNA寡核苷酸。
Strandase法示意图
操作步骤：
1 通过合适的方法（克隆、融合PCR等）制备dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是欲knockin的外源序列。
2. 在dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物，制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。
3. 添加Strandase Mix A，开始消化正义链或反义链。接着，添加StrandaseMix B完成降解反应，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。
专家建议：同时制备ssDNA正义链和反义链并独立用于knockin实验。
小结：该方法可以制备5 Kb以内的ssDNA，试剂盒中有配套的dsDNA和ssDNA纯化试剂盒，操作十分简单，也比较节省时间。
推荐指数：★★★★★
磁珠法示意图
所需试剂:
磁珠（Promega，Cat. Z5481）
操作步骤：
1. 通过合适的方法（克隆、融合PCR等）制备dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是knockin的外源序列。
2. 在dsDNA的不同位置上结合生物素标记的引物，制备出两种不同的dsDNA作为反应的底物。添加streptavidin PMPs，通过生物素-亲合素系统，将模板与磁珠结合;
3. 通过热变性或着碱变性，使DNA双链变成DNA单链，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。
专家建议：同时制备ssDNA正义链和反义链并独立用于knockin实验。
小结：该方法也比较简单方便，具体能制备多长的ssDNA还有待探索。
推荐指数：★★★★
总之，四种方法均可以用于合成单长链的ssDNA，具体选择那种方法，需要根据实验室的具体情况进行选择呦~
参考文献：
Miura, H. et al. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion ofartificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific reports 5,12799.
Wilson,R. Preparation of single-stranded DNA from PCR productswith streptavidin magnetic beads. Nucleic acid therapeutics, 21(6), 437-440.
关于酵母双杂交系统，你一定需要知道这些！！
蛋白定量有多难？掌握方法再说话！
图片模糊显Low？【高清图制作方法】用起来！
教你轻松搞定【系统发育树】！附送：作图软件！
SCI文献要收费？大神教你免费下载！