导读：蔬菜水果富含人体所必需的营养物质，包括糖、维生素、无机盐、及植物纤维。除了这些耳熟能详的营养物质外，近几年研究发现， 蔬菜水果里的小分子RNA—microRNA（miRNA） ， 也可以被人体吸收。这些植物miRNA经口服进入消化道后，不仅能稳定生存下来，还能被机体吸收进入血循环，从而在不同靶器官发挥作用。本文将围绕“植物miRNA的吸收”以及“植物miRNA如何在动物体内发挥作用”两个问题来介绍这些闯入动物王国的植物miRNA。
（引自2015，Lu Han et al., Frontiers in Plant Science）
撰文丨汪劼 博士（Cell Research 编辑部）
miRNA是一类不编码蛋白质的单链小分子RNA， 长度为20~24个核苷酸 ，能够通过序列配对，结合到靶基因mRNA上，特别是mRNA的3’端非翻译区(3’-untranslational region, 3’-UTR)。如果序列完全匹配， 会造成目标mRNA被切割，断裂的mRNA之后会被降解。如果miRNA和目标mRNA不完全互补结合，这将抑制mRNA翻译成蛋白质，而不影响mRNA的稳定性。以上也是哺乳动物miRNA作用的两种主要方式。miRNA本身不具备酶活性，所以它要发挥作用，需要把一个具有酶活力的蛋白质复合物——RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC) 引到目标mRNA上。RISC的核心分子是argonaute (Ago)，对于目标mRNA的切割或者翻译抑制，都是必不可少的(图 1)。
图 1 比较动植物miRNA的合成和作用方式。(A) 植物miRNA的合成和作用方式。RNA聚合酶II (RNA polymerase II, Pol Ⅱ)催化生成pri-miRNA，随后核内的核糖核酸酶DCL1实施两次切割，先后生成具有茎环结构pre-miRNA以及miRNA/miRNA* duplex，随后miRNA/miRNA*的3′末端会被HEN1酶加上甲基化。这一对miRNA会经由HSTY1从核内被运到胞浆。在这里，一条miRNA和Ago蛋白结合(不和Ago结合的miRNA*会被降解)，形成RISC复合物，通过miRNA-mRNA的序列配对，结合到高度匹配的目标mRNA上，切割mRNA，最终导致mRNA降解。(B) 动物miRNA的合成和作用方式。Pol Ⅱ 催化生成pri-miRNA，pri-miRNA经核酸酶Drosha剪切形成70个核苷酸左右的具有茎环结构的pre-miRNA。输出蛋白5(exportin 5, Exp5; 动物的Exp5和植物的HSTY1是同源物)能够将pre-miRNA从细胞核转运到细胞浆。细胞浆内的Dicer酶会进一步切割pre-miRNA，形成miRNA/miRNA* duplex。和植物中类似，一条miRNA和Ago蛋白结合，形成RISC复合物，通过miRNA-mRNA的序列配对，结合到目标mRNA上。很多情况下，序列只是部分匹配，会抑制蛋白质翻译。如果序列高度匹配，会引起mRNA切割以及降解。
一、动植物miRNA的差异
miRNA广泛存在于动植物各类细胞。但动植物的miRNA存在很多不同。总结起来有以下几点[1]：
(1)编码miRNA的基因在动植物基因组的位置不同：植物中，编码miRNA的基因大部分位于编码蛋白质基因之间的区域(intergenic region)，具备独立的转录元件。哺乳动物中，除了上面提到的位置，miRNA基因还存在于内含子中，即夹杂在编码蛋白质的基因内，这样就可以“借用”临近基因的转录元件。由于定位不同，再加上动植物间基因组序列的差异，动植物miRNA序列大相径庭，比如很多植物miRNA在动物中并不存在。
(2)动植物miRNA的合成过程中的不同：尽管动植物miRNA的合成都涉及“两步”切，即从初级转录物(primary miRNA, pri-miRNA)切割成miRNA前体(pre-miRNA)以及pre-miRNA进一步经切割形成成熟miRNA，但两者的合成仍然存在3大主要差异：首先，植物miRNA的合成完全在细胞核内完成，“两步”切全由核内的类Dicer 1(Dicer-like 1, DCL1)完成。而动物miRNA 后半段的合成在胞浆内完成。在核内完成由Drosha介导的第一切后， pre-miRNA出细胞核，在胞浆内遇到Dicer，完成第二切。 可能是由于第一切用的酶不同 (植物用DCL1，动物用Drosha)，植物miRNA长度多为21个核苷酸，动物miRNA稍许长些，为22~23个核苷酸。合成过程还有个不同是，植物miRNA在完成“两步”切后，会在3’末端加上甲基化修饰，这样能预防被降解。相反，动物miRNA很少有这种修饰(图 1)。
(3)动植物miRNA作用方式不同：植物miRNA和目标mRNA结合需要两者高度的序列匹配，一旦结合，直接降解目标mRNA。而许多动物miRNA能作用于部分互补的mRNA区域，抑制其翻译成蛋白质。所以，动物miRNA在底物选择上更为灵活，动物miRNA和目标mRNA间可以是“一对多”(一个miRNA调控多个mRNA)或者“多对一”的关系(一个mRNA可以被多个miRNA调节)。相反，植物领域，这种关系往往是“一对一”。所以，动物miRNA得以调控的靶基因范围更加广泛。
由于在合成和作用方式等方面的不同(图 1)，一直以来，动植物miRNA被当做两个不同国度的产物，它们应该局限在各自国度发挥作用。再加上RNA不稳定的特性，很难想象miRNA能有“跨国度”的效应。但近几年这种观点被打破，人们发现植物miRNA竟然也可以进入动物体内行使功能。
二、在动物体内发现植物miRNA
2012年，中国南京大学的张辰宇教授课题组首次报道了这一惊人发现。他们利用多种检测手段证实人和小鼠血液里存在植物miRNA。在这其中，一个名为miR168a的植物miRNA在血液里的丰度特别高。有意思的是，小鼠吃了大米(富含miR168a)后，血液里miR168a水平明显升高，说明植物miRNA能被肠道吸收进入血循环。这篇文章还揭示，miR168a在动物体内能调节基因表达，从而影响动物的脂类代谢(详细讨论见后)[2]。这一发现一经报道受到科学界的大量关注。多个课题组随后也进行了类似研究，但结果极富争议。多个课题组未能在动物血液里检测到植物miRNA，质疑声一时此起彼伏[3]（BioArtPlants注：此领域将有新的工作发表，请关注公众号的推送！）。
面对质疑，张辰宇教授曾发文给予回应。他强调要成功检测到这些特殊的植物miRNA，优化检测手段是关键。比如，测序技术常被用来检测miRNA。测序前需要先给miRNA连上个接口，这样就能从一端去读取序列。但植物miRNA的3′ 末端存在甲基化修饰 (2′-O-methylation；哺乳动物miRNA缺乏此种修饰)，这就像一个帽子，把植物miRNA盖起来，接口很难连上去，也就检测不到它们的存在。除了优化技术手段，采用合理的实验设计以及实验对照，也都十分关键[4]。这几年，多个研究组先后在哺乳动物体内检测到植物miRNA[5-8]，为植物miRNA的这种“跨国旅行”提供了确凿的证据。
三、 植物miRNA如何被吸收？
降解RNA的酶在大自然中处处都是，活性也非常强，而且RNA是单链分子，不稳定，所以RNA非常容易被降解，miRNA亦是如此。所以植物miRNA要完成“跨国旅行”并非易事。那么究竟为何植物miRNA进入动物体后不仅没被降解，反而还被吸收了呢？
植物miRNA通过消化道进入体内，首先要过的第一关是胃，那里存在大量的胃酸，通常我们会认为这些miRNA的奇妙旅程可能就到此为止了，但事实似乎不是这样。研究表明植物miRNA可经由消化道进入体循环。那么问题来了，植物miRNA是如何抵抗胃酸的侵袭？为了解答这一问题，科学家曾把动植物的miRNA放在pH 2.0的溶液里(模拟胃酸环境)，有意思的是植物miRNA的降解速度明显要比动物miRNA慢[2]。考虑到植物miRNA的3’末端具有甲基化修饰，能帮助其变得更稳定，那会不会是甲基化修饰给植物miRNA提供了一把“保护伞”呢？于是科学家在体外合成了不带甲基化修饰的植物miRNA，结果发现，这种miRNA在酸性环境里很不稳定，说明植物miRNA的3’末端甲基化修饰可能帮助植物miRNA抵挡胃酸的侵蚀[2]。
过了胃酸这关，植物miRNA仍需应对动物体内大量RNA酶的进攻，这又是如何实现的呢？多篇报道证实，植物miRNA在动物体内并不是“裸露”的，它们大部分都会被包裹在囊泡里[2,8]。 这些囊泡是由细胞分泌，具备脂质双层膜结构。这些囊泡里含有特异的蛋白、脂质和核酸，是细胞间进行信号传递(包括传递miRNA)的一个重要载体[9]。那么植物miRNA是在哪里、如何被包进这些囊泡的呢？目前推测，植物miRNA进入肠道后，会被小肠上皮细胞摄取，并把这些外来的miRNA包裹在囊泡内，释放到血循环(图 2)。“躲”在囊泡里的植物miRNA能避开RNA酶的攻击，安全抵达组织器官，除此以外，囊泡里的植物miRNA似乎更容易在靶器官发挥作用[2]，其中原因可能有两个，一是细胞更容易“吞进”囊泡，增加了植物miRNA进入靶细胞的几率。第二，囊泡里同时还包裹了重要的酶物质如Ago， 这些酶可以和植物miRNA“并肩作战”，发挥功效。但以上这些很多还只是假说，有待于进一步实验验证。而且并非所有植物miRNA都存在于囊泡内， 那些“裸露”miRNA怎样被吸收还是个悬而未决的问题。
图 2 植物miRNA的吸收和作用方式。植物miRNA(蓝色曲线)能够经口服进入动物消化道，随后大部分可能被小肠上皮细胞摄入，包裹进囊泡，再分泌到血循环。少部分“裸露”植物miRNA也能在血液中检测到，但它们的吸收机制还不清楚。目前已知，进入血循环的植物miRNA可以进一步到达靶器官，影响机体基因或是进入机体病原体基因的表达，从而影响动物体内脂质代谢、病毒感染以及肿瘤生长。
四、植物miRNA进入体内后，做了些什么？
植物miRNA进入动物体内后，它们的功效取决于两个因素：第一，到达了哪个器官，被哪类细胞吸收；第二，能和动物体内哪些mRNA相互作用。除了消化道以及血循环，在动物多个脏器比如肝、肾、心肺以及乳腺都有发现植物miRNA的踪影。目前已知的植物miRNA在动物体内的作用有三个：影响脂类代谢、抗病毒以及抗肿瘤(图 2)。
4.1影响脂类代谢
miR168a是第一个被报道的能在动物体内产生作用的植物miRNA。在汉族健康人群的血浆里可以检测到这个miRNA。给小鼠喂食大米后(富含miR168a)，小鼠血浆内的miR168a含量上升近三倍。除了血浆，多个器官均能检测到miR168a，其中肝脏里miR168a的量最高。与这个定位一致的是，科学家发现miR168a在动物体内的“靶点”是低密度脂蛋白受体衔接蛋白1 (low-density lipoprotein receptor adapter protein 1, LDLRAP1)，而这个蛋白正是特异性地表达在肝细胞里。肝细胞是清除携带胆固醇的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)的重要场所，LDLRAP1对这一清除过程必不可少。LDLRAP1缺失，会妨碍LDL降解，导致血浆胆固醇浓度升高。给小鼠喂食植物miR168a或者大米后，肝脏内LDLRAP1含量下降，并伴有血浆LDL以及胆固醇含量的升高。如果在大米饮食里加上miR168a拮抗剂，这些表型就能被逆转，说明miR168a确实通过它的靶点LDLRAP1来影响动物的脂蛋白代谢[2] (图 2)。
之前提到，动植物miRNA的作用方式有许多不同。那么进入动物体内的植物miRNA起作用时是保持“个性”，还是会“入乡随俗”，像动物miRNA那样起作用？在miR168a这个例子里，似乎是两边都有兼顾。首先，miR168a和LDLRAP1的结合区域序列高度匹配，符合植物miRNA的特性；其次，这个结合区域位于LDLRAP1的第四个外显子，这一点也是在动物miRNA领域很少见的，大部分动物miRNA都是结合到3′-UTR。以上两点都秉承了植物miRNA的特性。但有意思的是，尽管miR168a和底物序列高度匹配，却并不降解mRNA，反而是抑制了翻译，使得LDLRAP1蛋白质虽然减少，但mRNA含量不变，这一点就更贴近动物miRNA。这种“入乡随俗”可能是由于miR168a借用了动物体内的Ago蛋白而造成的[2]。
在以上这个例子里，植物miR168a进入动物体内，升高了血液胆固醇浓度，不利于机体健康。这一方面给我们带来一个警惕，要小心植物miRNA进入人体后带来的潜在危险，但同时也提供了一个线索，以后治疗代谢相关疾病，利用植物miRNA也是一个值得考虑的方向。
4.2抗病毒
许多中药具有抗病毒功效，金银花就是其中之，它具有清热解毒、抗菌消炎等功能。科学家通过测序发现，金银花里含有一百多种miRNA，煎煮后大部分都降解了，miR2911却个例外，它仍然稳定存在于金银花汤药里，提示很有可能miR2911是金银花的一个有效成分。小鼠实验证明，口服金银花汤药或者人工合成miR2911，可以有效抵抗包括H1N1在内的多种流感病毒的侵袭。但在金银花汤药里加上miR2911拮抗剂后，这种抗病毒效果大打折扣，提示miR2911是金银花抗病毒的一个有效成分[10]。那miR2911又是如何抗病毒的呢？科学家发现，miR2911能特异性地抑制流感病毒的两个重要蛋白(PB2 和 NS1)的表达，从而阻碍了病毒复制。无论是口服金银花汤药还是摄入人工合成的miR2911后，都能在小鼠血循环以及肺里检测到miR2911的升高，说明miR2911能到达正确的器官发挥作用 [10]。（备注：不同于经典miRNA，miR2911来源于核糖体RNA[6]）。
3.3抗癌
动物体内存在“抑癌”miRNA，给肿瘤治疗提供了新的方向。那么植物miRNA是否具备抗癌功效呢？考虑到植物miRNA进入动物体内后，首先接触到是消化系统，很容易想到用植物miRNA来治疗消化道肿瘤。有研究合成了特殊的miRNA， 这些miRNA本是哺乳动物“抑癌”miRNA，但是人为地加上了3’末端甲基化修饰，“装扮”成植物miRNA。给患有结直肠腺瘤的小鼠喂食这类miRNA，能产生明显抑瘤效果[5]。至于是否存在抗消化道癌肿的天然植物miRNA，还有待进一步实验验证。
植物miRNA能进入血循环，理论上讲，应该也能抗消化系统以外的肿瘤。最近，有个美国的研究组在健康人和乳腺癌患者的血清里检测到了一个植物miRNA——miR159。它在血清里的含量和乳腺癌的发展成负相关，提示它可能是个“抑癌”miRNA。小鼠实验也证实了miR159抗乳腺癌的功效。那么miR159是如何“抑癌”的呢？课题组发现miR159能结合到促癌基因TCF7 mRNA的3’UTR区域，降解TCF7 mRNA，从而达到抗癌的功效[8]。那我们血清里的植物miR159从哪里来的？科学家发现，多种蔬菜比如菠菜和西兰花里都含有高水平miR159。水煮后，在西兰花里仍能检测到miR159的存在[8]。西兰花一直是餐桌上的健康蔬菜，它抗癌效果特别是在预防治疗乳腺癌方面的功能已经被证实。比如西兰花里的吲哚衍生物能降低雌激素水平，可预防乳腺癌的发生。miR159的“跨国度”效应为西兰花抗癌提供了又一直接佐证。
五、哪些植物miRNA能进入体内？是什么决定了这些miRNA的这种“特殊”性？
植物里有大量miRNA的存在，但其中只有很少一部分能被动物吸收。是什么导致这种选择性？我们之前提到的可能帮助“抗酸”的3′末端甲基化修饰是所有植物miRNA都具备的特性，不能解释这种选择性。那么容易想到的是，可能是植物miRNA本身的序列以及带有的其他修饰决定了这种选择性。比如之前提到的miR2911，煎煮后它仍能稳定存在。miR2911的序列里有很多的GC，把部分GC改掉，miR2911的这种“不怕煮”的特性就消失了，说明miRNA的某些序列特性能帮助他们变得更加稳定。会不会这些特殊的序列特征也会改变miRNA的构象，帮助它们被机体吸收呢？我们仍需要更多的实验研究来解答这一疑问。
除了3’末端甲基化，植物miRNA还有很多其他的修饰，这些修饰会改变RNA构象和功能，很有可能是决定这种吸收选择性的又一原因。最后，动物体也可能也参与了这种“选择性”的建立。血浆里的植物miRNA很多并非裸露，而是存在于囊泡里。到底是否像科学家提出的那样，小肠上皮细胞能把植物miRNA包裹进特殊的囊泡，再分泌到血液里，需要明确的科学证据。同时在这个包裹过程中是否存在选择机制，也是有待研究的有趣问题。
六、 我们如何利用植物miRNA？
植物miRNA的这些“跨国度”的效果，让我们不禁想把它们开发成有一剂良药。单纯靠多吃某一类植物来达到治疗效果，可能起效不会太快。直接口服人工合成的植物miRNA似乎是最“简单”的方式，但小鼠实验证实这种给药方式不利于吸收，而把这些合成miRNA与植物(比如金银花汤药)混在一起服用，似乎效果更好[6,7]。可见植物里的某些未知成分能帮助miRNA的吸收。在目前机制不明的情况下，培育富含特定miRNA的转基因植物可能是个不错的选择。这样生产出的植物miRNA可以拥有天然的构象和修饰，可能会比合成miRNA更易被吸收，同时植物本身能起到促吸收的作用。
七、 结语
植物miRNA的“跨国度”作用还有许多未解之谜。首先，它们在体内的吸收和运输问题仍是亟待研究的课题。从植物miRNA角度来说，它们本身的序列特性、化学修饰以及和其他食物成分的相互作用都可能影响它们的吸收。今后随着越来越多“跨国度”植物miRNA的发现， 我们也许可以总结出这些特殊miRNA的共性，帮助我们发现吸收中的规律。从哺乳动物的角度来讲，是如何把植物miRNA包进囊泡？ 包裹是否有选择性？是否是在小肠上皮细胞内完成？ 等等这些问题都有待进一步研究解决。植物miRNA能在动物体内做什么，也是我们需要考虑的另一个问题。
从目前的研究结果来看，植物miRNA能利用动物体内的RNA干扰的机器 RISC来行使功能，而且作用方式和动物miRNA类似。考虑到植物miRNA毕竟来自另一个生物国度，它究竟和动物miRNA作用有没有不同呢？如果碰到同一个目标mRNA，动植物miRNA之间会不会产生竞争？还是能够产生种新的“合作”模式？这些也是值得关注的问题。总之，我们对于这些闯入动物王国的植物miRNA的认识还只是“冰山一角”，随着更多的谜题浮出水面，植物miRNA能有望能成为治疗人类疾病的又一利器。
参考文献
1. Axtell MJ, Westholm JO, Lai EC. Vive la difference: biogenesis and evolution of microRNAs in plants and animals. Genome biology. 2011;12(4):221.
2. Zhang L, Hou D, Chen X, et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell research. Jan 2012;22(1):107-126.
3. Dickinson B, Zhang Y, Petrick JS, Heck G, Ivashuta S, Marshall WS. Lack of detectable oral bioavailability of plant microRNAs after feeding in mice. Nature biotechnology. Nov 2013;31(11):965-967.
4. Chen X, Zen K, Zhang CY. Reply to Lack of detectable oral bioavailability of plant microRNAs after feeding in mice. Nature biotechnology. Nov 2013;31(11):967-969.
5. Mlotshwa S, Pruss GJ, MacArthur JL, et al. A novel chemopreventive strategy based on therapeutic microRNAs produced in plants. Cell research. Apr 2015;25(4):521-524.
6. Yang J, Farmer LM, Agyekum AA, Elbaz-Younes I, Hirschi KD. Detection of an Abundant Plant-Based Small RNA in Healthy Consumers. PloS one. 2015;10(9):e0137516.
7. Yang J, Farmer LM, Agyekum AA, Hirschi KD. Detection of dietary plant-based small RNAs in animals. Cell research. Apr 2015;25(4):517-520.
8. Chin AR, Fong MY, Somlo G, et al. Cross-kingdom inhibition of breast cancer growth by plant miR159. Cell research. Feb 2016;26(2):217-228.
9. Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. Jun 2007;9(6):654-659.
10. Zhou Z, Li X, Liu J, et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses. Cell research. Jan 2015;25(1):39-49.
备注：本文原载于《生命的化学》2016, 36(3): 404-408，BioArt获授权发布。