Plus深读 | 表观遗传中液样凝聚体的时空调控

2023-05-10 14:56:27


原文链接:

http://www.nature.com/articles/s41586-018-0132-0

 

表观信息能够跨代遗传(transgenerational epigenetic inheritance, TEI)1,其中非编码RNAs扮演着重要的角色,但其具体机制尚不清楚。在许多真核生物中,双链RNA(double-stranded RNAs,dsRNAs)通过序列互补结合沉默细胞内其它RNA,即RNA干扰(RNA interference,RNAi)2。在C. elegans(秀丽隐杆线虫)中,RNAi是可遗传的:在缺少进一步dsRNAs暴露的情况下,线虫繁殖许多代后,其子代仍能产生暴露dsRNAs时对应的RNAs,能沉默互补的RNAs3, 4。非膜包围的细胞器,如核仁、处理小体(processing bodies)和卡哈小体(Cajal bodies)等,能自发组装特定的蛋白质和RNAs的凝聚体,但这些分子凝聚体如何形成和相互作用,尚不清楚。本文的研究工作者确定,ZNFX-1和WAGO-4蛋白与C. elegans早期胚胎卵裂球的P颗粒存在共定位,而在发育后期,ZNFX-1和WAGO-4蛋白能从P颗粒分离形成独立的液样凝聚体,该研究工作者命名为Z颗粒。在成熟的生殖细胞中,Z颗粒和P颗粒以及Mutator foci形成有序的三滴状凝聚体,该研究工作者命名为PZMs颗粒。最终,本文研究工作者发现,在C. elegans的生殖细胞中,ZNFX-1和WAGO-4蛋白与沉默RNAs相互作用指导跨代表观遗传。


一、主要材料和实验方法

1,主要材料

C. elegans:通身透明,一般为雌雄同体,生长周期分为胚胎期、幼虫期和成虫期,一般而言,秀丽隐杆线虫经历四个阶段的幼虫期(L1、L2、L3、L4)后变成成体,是分子生物学和发育生物学研究领域的模式生物。

2,实验方法

(1)RNAi实验:次氯酸盐处理漂洗孕期成虫收集虫卵(胚胎),喂养表达特定基因dsRNA的HT115细菌,完成RNAi,详见原文;

(2)免疫共沉淀:用于确定ZNFX-1和WAGO-4之间存在相互作用;

(3)免疫荧光:在体确定蛋白细胞定位;


补充知识:

液样凝聚体(Liquid-like condensates)5:是一种自组装的细胞结构,特定蛋白质和RNAs从细胞质中发生液-液转变时形成,呈球形,可进行快速的内部重组。


二、实验结果

1,  TEI需要ZNFX-1蛋白

为研究RNA介导的TEK,该研究工作者在C. elegans中通过基因筛选确定37个突变破坏RNAi遗传,进一步的全基因组测序发现,其中zk1067.2基因有4个独立突变。序列分析预测ZK1067.2编码2443个氨基酸的蛋白质,含有一个SF1 RNA解螺旋酶结构域和一个锌指结构域(如图1a)。该研究工作者推测ZK1067.2广泛存在于大多数真核生物基因组,同源分析发现,其在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和粉色面包霉菌(Neurospora crassa)中与RNAi相关6, 7,但不含有锌指结构域;而在哺乳动物中,其同源物为ZNFX-1,含有锌指结构域,因此,该研究工作者初步认为在许多真核生物中,ZK1067.2是参与RNAi介导的基因沉默的保守蛋白,并在研究中以ZNFX-1代指ZK1067.2。为确定ZNFX-1是否介导RNAi遗传,研究工作者利用pie-1::gfp::h2b转基因线虫8暴露于gfp dsRNA,检测了ZNFX-1基因突变体gg575对RNAi遗传的作用,如图1b所示,与野生型WT相比,该突变体P0时接受gfp RNAi后其F1代不能遗传P0中gfp RNAi作用,因此,ZNFX-1对线虫的RNAi遗传很关键,即ZNFX-1参与RNAi遗传。为进一步研究ZNFX-1在RNAi遗传中的功能,该研究工作者利用CRISPR-Cas9技术在ZNFX-1启动子上游插入3xflag::gfp的序列,其表达的GFP::ZNFX-1蛋白接近野生型水平而且功能正常。如图1c,GFP::ZNFX-1蛋白在线虫的胚胎期和幼虫发育阶段中的成熟生殖细胞和正在形成的生殖细胞中都有表达,但是体细胞中没有表达;在受精后,线虫的受精卵发生一系列的不对称的细胞分裂,此时,生殖决定子与生殖分裂球发生分离;GFP::ZNFX-1蛋白在生殖分裂球中聚集而且与其一起被隔离。此外,在线虫成熟生殖细胞中,GFP::ZNFX-1聚集在细胞核周围,如图1d,其中紫色标记的是染色体。因此,znfx-1编码生殖细胞特异表达的蛋白,并且在成熟生殖细胞中定位在细胞核周围。


图1 ZFX-1是秀丽隐杆线虫中RNAi遗传所需的RNA解螺旋酶


C. elegans中,oma-1 dsRNA能够沉默oma-1几代9。为确定ZNFX-1在何时促进RNAi遗传,在znfx-1(−)线虫及其子代暴露于oma-1 dsRNA后,该研究工作者通过RT-qPCR检测了oma-1的mRNA和前体mRNA的表达水平,如图1e所示,znfx-1(−)线虫对oma-1 dsRNA响应正常,但是其子代对oma-1 dsRNA不响应,这提示ZNFX-1在RNAi遗传阶段发挥作用。进一步研究发现,当znfx-1(−)线虫直接暴露于oma-1 dsRNA时,oma-1 siRNAs产生水平与野生型相同,但这些突变体的子代并不能表达oma-1 siRNAs(如图1f)。


以上证据显示,ZNFX-1是一个RNAi遗传因子。


2,   WAGO-4与ZNFX-1协同指导TEI

秀丽隐杆线虫的基因组编码约27个AGO蛋白(Argonaute),但许多分子功能并不清楚。该研究工作者在筛选破坏RNAi遗传的突变时发现AGO编码基因wago-4存在两个突变体,如图1b所示,与野生型WT相比,该wago-4突变体tm1019的P0时接收gfp RNAi后其F1代不能遗传P0中gfp RNAi作用,因此,与ZNFX-1相似,WAGO-4参与线虫中RNAi遗传。为确定ZNFX-1和WAGO-4之间是否存在相互作用,研究工作者分别在ZNFX-1和WAGO-4启动子上游插入TagRFP和GFP,分别形成TagRFP::ZNFX-1融合蛋白和GFP::WAGO-4融合蛋白,如图2a,ZNFX-1和WAGO-4在细胞核周围形成共定位,这提示两者可能存在相互作用。免疫共沉淀实验显示,WAGO-4和ZNFX-1存在相互作用(如图2b),其中HA::HRDE-1是阴性对照。此外,ZNFX-1和WAGO-4突变体具有相似的表型,如图2c,当线虫生长在25℃条件下时,该突变体的子代数量逐渐减少,在第5代时基本产生子代,即ZNFX-1和WAGO-4突变体都展示温度敏感性的生殖细胞致死表型。因此,WAGO-4与ZNFX-1协同参与代间以RNA为基础的表观信息传递。


   

图2 ZFX-1和WAGO-4协同驱动RNAi遗传


WAGO-4和ZNFX-1如何促进RNAi遗传并不清楚。ZNFX-1最近的同源物是SMG-2(也称UPF1),其能标记mRNAs10,因此,研究工作者推测,ZNFX-1可能通过结合标记mRNAs实施遗传的基因沉默。为验证这一猜想,研究工作者使线虫表达3×Flag::ZNFX-1并使用oma-1 RNAi,免疫共沉淀3×Flag::ZNFX-1后使用RT-qPCR检测是否oma-1 RNAi导致ZNFX-1与oma-1 mRNA相互作用,如图2d上,在野生型中,oma-1 RNAi显著提高ZNFX-1与oma-1 mRNA的结合,但删除ZNFX-1的解螺旋结构域后不能有效结合oma-1 mRNA,此外,在WAGO-4(tm1019)突变体内,ZNFX-1不能与oma-1 mRNA相结合,因此,ZNFX-1与WAGO-4协同响应RNAi,靶向结合目的基因的mRNA。


3,ZNFX-1和WAGO-4能从P颗粒中分离

与ZNFX-1和WAGO-4相似,在C. elegans胚胎发育过程中,P颗粒与胚胎卵裂球(P0-P4)一同分离11,一般可以使用PGL-1蛋白标记P颗粒,MEG-3和MEG-4是P颗粒形成所需的蛋白。如图3a和3b,ZNFX-1和WAGO-4与PGL-1存在共定位,而在MEG-3/4缺失的情况下,ZNFX-1和WAGO-4不能与PGL-1共定位,因此,在P1-P3卵裂期早期,ZNFX-1和WAGO-4定位于P颗粒。当胚胎发育至100个细胞时,P4卵裂球分裂产生Z2和Z3,这是线虫最原始的生殖细胞。如图3c,研究工作者发现,与P2相比,在Z2/Z3生殖细胞中,ZNFX-1和WAGO-4不能与PGL-1共定位,但是空间距离很近,提示ZNFX-1和WAGO-4从P颗粒中分离出来。定量分析ZNFX-1与PGL-1的共定位程度,如图3d,随着发育(P1-P4),ZNFX-1与PGL-1的相关性逐渐降低,而ZNFX-1和WAGO-4相关性很高(R2在0.8左右),与此一致的是,随着时间(0min~30min),ZNFX-1与PGL-1逐渐分离(如图3e和3f)。因此,在胚胎发育后期,ZNFX-1和WAGO-4从P颗粒中分离出来但与其相邻,研究工作者将ZNFX-1和WAGO-4复合体命名为Z颗粒。


图3 ZFX-1和WAGO-4在生殖发育中从P颗粒分离形成新的复合体


图4 Z颗粒在结构上与P颗粒和增变基因形成三体凝聚物


4,Z颗粒能组装成三滴状结构

秀丽隐杆线虫的生殖细胞中至少存在其他两种凝聚体(处理小体和Mutator foci)与液样凝聚体具有相似特性12, 13,使用MUT-16标记Mutator foci,PATR-1和DCAP-1标记处理小体。ZNFX-1与PATR-1和DCAP-1都没有共定位(详见文献Extended Data Fig. 7)。如图4a,ZNFX-1与MUT-16没有共定位,但空间距离相邻,与PGL-1也是这样,而WAGO-4与PGL-1相邻,MUT-16与PGL-1没有共定位,且具有一定空间距离,这提示Z颗粒和P颗粒与Mutator foci在空间上可能存在相互作用。定量的距离分析更加确认这一点,如图4b,PGL-1与ZNFX-1、 ZNFX-1与WAGO-4、ZNFX-1与MUT-16、WAGO-4与PGL-1几乎没有表面距离,即相邻,而MUT-16与PGL-1的表观距离在120nm左右。以上证据显示,Z颗粒与P颗粒以及Mutator foci可形成三滴状结构,即PZMs,如图4c所示,其中Z颗粒起着连接P颗粒和Mutator foci的作用。


在明确Z颗粒与P颗粒以及Mutator foci形成三滴状结构后,研究工作者思考,PZMs是否是RNA指导TEI所必须的。已有文献报道8, 12,许多因子聚集在Mutator foci促进RNA指导的TEI。DPES-1是成熟生殖细胞中P颗粒形成所必须的,删除dpes-1基因后,与ZNFX-1突变体相似,其子代对dsRNA不响应(详见文章Extended Data Fig. 9),即P颗粒参与RNA指导的TEI。因此,PZMs组装对RNA指导的TEI具有重要作用。


三、讨论和思考

图5 PZMs组装在RNAi遗传中的作用模型


在本研究中,研究工作者发现遗传因子ZNFX-1和WAGO-4共定位于液样凝聚体,命名为Z颗粒。由于Z颗粒伴随生殖细胞分离,该研究工作者推测Z颗粒在生殖细胞中能聚集和分离沉默因子促进以RNA为基础的TEI。在裂殖酵母中,ZNFX-1的同源物Hrr1能与AGO和RdRP组装成复合体(也称RDRC)扩增siRNA指导着丝粒周围异染色质形成,同时结合上述研究,该研究工作者推测线虫中的RDRC在细胞质中促进RNAi遗传(如图5):

1,  通过WAGO-4结合遗传的siRNA;

2,  通过ZFNX-1标记mRNA使其与遗传的siRNA互补;

3,  使用标记的mRNA作为RdRP扩增siRNA模板;


ZNFX-1和WAGO-4(Z颗粒)在线虫胚胎发育早期过程中能从P颗粒中逐渐分离出来,研究工作者推测新合成的mRNAs通过P颗粒运输,当其与RNA结合蛋白作用时改变了局部蛋白浓度起始了Z颗粒的分离。Z颗粒在空间上与P颗粒和Mutator foci有序排列组装,这提示我们液样凝聚体的组装和排列依赖时间和空间。基于此,该研究工作者推测液样凝聚体随时间和空间的有序组装有助于组织和调整小RNA通路,包括RNA指导的TEI。然而,本研究仍值得进一步深入研究,现将未解决问题整理如下:

1,  PZMs如何正确组装或者说是通过哪些结构域结合?

2,  PZMs怎样促进以RNA为基础的TEI?

3,  PZMs本身受到怎样的调控?

此外,研究工作者提出的秀林隐杆线虫中RDRC在细胞质中促进RNAi遗传的作用机制中的核心蛋白RdRP在PZMs指导的RNAi遗传中的作用仍需进一步的实验证实:

Step1:明确RdRP参与线虫RNAi遗传,具体方法与文中确定ZFNX-1和WAGO-4参与RNAi遗传的方法相似;

Step2:免疫荧光检测RdRP与PZMs的空间关系:相邻、共定位或者未接触;

Step3:免疫共沉淀确定RdRP与PZMs是否存在相互作用;

Step4:构建RdRP相应突变体,RT-qPCR或测序检测靶基因对应的siRNA是否发生扩增变化,评估RdRP在PZMs知道的RNAi遗传中的作用和功能。


参考文献

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11.Brangwynne, C.P. et al. Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729-32 (2009).

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