应用分享 | 重组蛋白纯化篇

2023-05-10 14:56:27

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重组蛋白的亲和层析纯化已经是当前实验室进行蛋白纯化最受欢迎的技术之一,其高效快速的特点获得了众多蛋白纯化人员的喜爱。一般来讲,一个典型的重组蛋白纯化,包含捕获,中间纯化和精纯几个步骤。理想的纯化是使用最少的步骤获得高质量、高产量的最终产品。但是,由于蛋白分子的结构多样性以及空间构象对其性质的影响,只有很少的蛋白在纯化过程中能够达到理想状态。这样,就需要蛋白化学家们进行不断的优化,以期达到最优的结果。




(传统IMAC纯化工艺方案)

如何简单快速的筛选并优化出最终的条件,成为了重组蛋白纯化中的一个重要工作。以传统IMAC为例(固定化金属鳌合层析/组氨酸标签的纯化),一个完整的纯化优化工艺包括对多达四个步骤的十二项参数进行优化和筛选。虽然在很多实际操作中并不需要筛选所有这些条件就能获得相对满意的结果,但是缺乏系统的有依据的优化则很难快速获得较好的结果,甚至需要花费更多的实验和精力来达到预期的结果。



(IMAC可优化参数)


既便是很多经验丰富甚至技艺高超的蛋白纯化学家也很难做到逐项条件的优化,但是他们也都承认这样的参数优化对最优工艺条件的探索以至于获得最好的纯化结果至关重要。制约纯化人员进行参数优化的一个主要的问题是这些优化需要大量的繁重的人工操作。


基于模块化可进行多维层析的NGC™纯化系统完美的解决了这一问题!NGC™纯化系统可以将多个纯化步骤的层析柱和溶液同时连接到仪器上,通过软件程序和多种阀门的配合实现整个工艺的自动摸索。多通道的进液阀门可以最多连接多达18种溶液,而柱切换阀可以连接最多15根层析柱,样品暂存阀门可以存储至5种中间样品。



NGC多维层析系统流路


以IMAC纯化为例,NGC™纯化系统可以在一天时间内完成了十二项参数的优化并获得最后的优化结果,这些结果可以通过智能化的ChromaLab软件进行自动化的分析。


此外,操作的中间步骤完全在系统内密闭进行,减少了失误和样品在转移过程中的损失,可以得到较高的收率。这对珍贵的样品尤为重要。


下图是针对IMAC的一个具体的实验,在本实验中纯化的样品具有GFP和IMAC双标签,所以可以通过280nm和495nm进行检测。280nm确定蛋白分离情况,495nm确定蛋白的纯度。最后蛋白的收率达到90%以上。


NGC多维层析系统上的IMAC纯化实验。A.IMAC四维层析实验。B.多维层析的重复性实验。C.多维层析的得率实验。D.IMAC多维层析得率结果表。


除了带有多重特征波长的蛋白,大多数蛋白只能利用280nm来进行检测。针对这一类的蛋白的全自动化多维层析,则需要在每一个步骤之后加入进行校验纯度的分子筛实验,当然这步检测是自动化完成的。也可以分步骤进行纯化,利用Stain Free 快速免染蛋白胶来确认纯化纯度,最后将各个步骤串联起来进行整个工艺的自动化实验并进行工艺评价。这一技术的具体方法我们会在以后的文章进行具体的介绍。



利用分子筛校验每步纯化纯度的多维实验方案



参考文献: 所有实验结果和配图来自于 Bulletin6769:Multidimensional(Multi-D) Histidine-Tag Protein Purification, Jeff Habel,Bio-Rad Laboratories. Inc. 600 James Watson Drive, Hecules, CA94547.



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