游离DNA的介绍和应用

2023-05-10 14:56:27

关于cfDNA

cfDNA(cell-free DNA),或者叫血浆游离DNA,是血浆中游离存在的DNA。它们的来源主要有两种:一种就是正常细胞凋亡过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸,它们的大小基本上在150-200bp左右。还有一种就是细胞被裂解——这种裂解既可以来源于物理性刺激引发的坏死,也可以是免疫细胞杀伤作用。这种过程产生的核酸很大,会接近基因组DNA大小。还有一些极痕量的cfDNA,会存在于不同类型囊泡结构中,如exosome。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)中的一类,占比约为0.1%-1%,主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体及循环肿瘤细胞。ctDNA片段大小通常为160-180 bp,在血液中半衰期2小时,携带有SNP(点突变)、InDel(插入缺失)、CNV(拷贝数)、fusion(融合基因)等突变信息,在人体血液循环系统中不断流动,可实时反映肿瘤患者当前信息。


游离DNA相关应用方向

1. 液体活检

近年来,液体活检技术飞速发展,利用血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)检测肿瘤相关分子标志物具有显著优势,尤其适用于较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织样本的患者,并在一定程度上克服肿瘤异质性。且在《ASCO年度报告:2015临床肿瘤学进展》中,液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一,ctDNA作为液体活检的首选已逐渐从科研走向临床。

1.1 实时反映肿瘤动态

近年来研究发现在非小细胞肺癌、乳腺癌和肠癌等多种肿瘤患者血液(血浆或血清)中都存在含量约为健康人10倍以上的游离DNA。可利用数字PCR技术检测患者治疗过程中的ctDNA,实时监控疾病进展。与影像学及其他常规指标相比,ctDNA突变及丰度改变通常会提前数月出现,这样就可以提醒医生及时调整治疗方案,使患者得到更有效的治疗。

1.2 辅助肿瘤治疗方案选择和疗效评价

检测药物靶点基因,分析基因变异与药物的关系,临床医生可根据肿瘤患者特有的基因变异推荐选择合适的药物;评估药物的疗效和相关毒副作用,实时监控用药治疗效果。ctDNA来自于肿瘤细胞,肿瘤细胞携带的某种基因突变也能够在ctDNA中反映出来。通过检测ctDNA的基因突变,就可以揭秘体内肿瘤组织的突变信息,从而为肿瘤的精准靶向治疗和药效检测提供依据。且欧盟批准将ctDNA检测用于易瑞沙的伴随诊断则更是标志着ctDNA临床应用的大规模实现。

1.3 预后评估与复发耐药检测

追踪肿瘤转归、转移和复发,监控肿瘤的演化和适应性改变,实时动态检测药物靶点突变,分析耐药性产生的根源,帮助医生适时调整治疗方案、选择合适的药物。

乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌密切相关,血浆乙型肝炎病毒DNA的载量与患者恶性转归相关,并且可提示患者的预后情况。鼻咽癌患者95%以上都有EB病毒感染,血清中EB病毒DNA水平可作为鼻咽癌的早期诊断及判断预后的指标。人状瘤病毒感染是宫颈癌的重要病因之一,研究显示,血清人状瘤病毒DNA可反映宫颈癌的生物学活性,宫颈癌患者早期血清人状瘤病毒DNA阳性提示愈后较差,可作为宫颈癌复发的检测指标。

2. 无创产前筛查

        NIPT检测胎儿的cfDNA在全球的快速运用:采集孕妇外周血(5ml),提取游离DNA,采用新一代高通量测序技术,结合生物信息分析,即可得出胎儿是否存在基因异常情况,如患染色体非整倍体(21-三体又称唐氏综合征,18-三体,13-三体)的风险。对比传统的羊水穿刺,提高检测准确性,降低取样要求;且对孕14-20周的孕妇进行cfDNA检测,其检测结果或许可以用于早产的预测,从而预防并降低早产风险。

3. 评估机体细胞损伤相关疾病

目前已经有很多文献,证实在包括系统性红斑狼疮在内的风湿性关节炎,肾小球肾炎,胰腺炎,炎症性肠病、肝炎等炎症疾病患者血浆中,都能够显著性地检测到cfDNA相比健康人群含量大大增加。临床上可通过cfDNA的含量变化,来对显著性的机体细胞损伤疾病进行评估。

4. 其他应用

cfDNA水平与外伤、卒中和炎症患者的疾病严重程度密切相关,游离DNA水平高者,疾病较严重。

对接受器官移植手术的病人,通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征,片段化的cfDNA含量变化,来评估移植器官的排斥反应情况。


中山大学达安基因股份有限公司开发的游离核酸检测试剂盒基于超顺磁性的磁性粒子纯化技术,利用磁珠与游离核酸特异性地识别和高效结合,并利用磁性分离器将磁珠分离出来,随后通过洗涤液的作用,将蛋白质、无机盐粒子和有机杂质去除,在洗脱液的作用下,将游离核酸洗脱下来,得到高纯度的核酸。

针对不同的客户需求,达安基因开发了三种不同的游离核酸解决方案:

1)手工法:可处理高达5mL人血清、血浆样本;洗脱体积灵活50-150uL;灵敏度高,可捕获血清或血浆中低至50pg/mL的游离核酸。

2)Ballet X3半自动提取平台:可处理高达2mL人血清或血浆样本,且提供预分装规格试剂,减少技术人员工作量;洗脱体积20-150uL;可40分钟内同时完成24个样本的核酸提取;灵敏度高,可高效稳定的捕获低至50pg/mL的游离核酸。


3)DA3000全自动提取平台:可处理高达5mL人血清或血浆样本,全程自动化处理样本,无需任何手工操作;洗脱体积100-150uL;可50分钟内同时完成24个样本的核酸提取;灵敏度高,可高效稳定的捕获低至50pg/mL的游离核酸。

    达安基因开发的游离核酸提取试剂盒性能可比肩国外同类试剂盒,对小片段核酸吸附的特异性强,纯度高。


达安游离核酸提取试剂

回收量(ng)

某进口游离核酸提取试剂

回收量(ng)

5mL肿瘤样本

11.3

7.25

5mL孕妇样本

9.35

2.8


    Qubit检测达安游离核酸提取试剂与某进口试剂提取肿瘤样本和孕妇样本游离核酸回收率


安捷伦2100分析肿瘤样本回收游离核酸片段大小:

蓝色为达安游离核酸提取试剂,红色为某进口试剂。



安捷伦2100分析孕妇样本回收游离核酸片段大小:

蓝色为达安游离核酸提取试剂,红色为某进口试剂。

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