蛋白桑:添加乳酸菌和发酵底物对桑叶青贮发酵品质的影响

2023-05-10 14:56:27

摘要:为开发桑叶作为非常规饲料资源,本试验探讨了添加乳酸菌、葡萄糖或糖蜜对桑叶青贮发酵品质的影响,试验设对照组( C )、乳酸菌组(P )、葡萄糖组( G )、糖蜜组( M )、乳酸菌 + 葡萄糖组( P+G )、乳酸菌 + 糖蜜组( P+M ),青贮后第 7 , 14 , 30 和 60 天开窖取样分析桑叶青贮饲料发酵品质。结果表明,添加乳酸菌加速了桑叶青贮过程中乳酸发酵,青贮第 7 天 P , P+G 和 P+M 组乳酸含量已达到 C 组的 6 倍以上,pH值降至 4.30 以下,其中 P+G 和P+M在青贮结束时降至4.0左右。补充发酵底物并未有效改善桑叶青贮发酵品质, C 、 G和 M 组 pH 值在青贮前30d始终保持在5.85以上,青贮60d时C组为5.96 , G和 M 组分别下降至5.35和5.24 ,显著( P <0.05)高于 P组。整个青贮过程中P组显示最高的乙酸含量,始终显著( P <0.05)高于 C、 G和 M 组,青贮7d后开始显著( P <0.05 )高于P+G和P+M 组。青贮第7天P组氨态氮/总氮显著( P <0.05 )低于对照组,之后各组氨态氮/总氮均随青贮时间的延长逐渐上升,其中P 、 P+G和P+M 组氨态氮/总氮显著( P <0.05)低于 C、 G 或 M 组直至青贮结束。本试验结论认为单独添加乳酸菌明显提高了桑叶青贮发酵品质,而组合添加并未进一步得到大的改善。关键词:桑叶;发酵品质;乳酸菌;葡萄糖;糖蜜  桑树( Morus  alba )原产于中国和朝鲜,在我国已有5000多年的栽培历史;中国是世界蚕桑生产的发源地,也是桑树种植面积最大的国家  。桑树为多年生深根性植物,适应性强,具有耐寒、耐酸碱等特性,在-40~40℃的气温范围和 pH 4.5~9.0的土壤上均能生长,因此,我国大部分地区均有桑树分布,常年种植面积在100万hm2左右  。桑树是目前木本叶用植物中产量最高的树种之一,桑叶每年可摘3~6次,桑树年产鲜物质平均15t / hm2 ,最高产量可达60t/ hm2 ,在我国有着极大的资源优势和开发前景。长期以来桑叶被单一的用作养蚕饲料,其优良的营养价值并未被完全开发和利用。桑叶中含有丰富的营养物质,可以与豆科牧草相媲美,其中粗蛋白质20%~30% 、粗脂肪4%~10% 、粗纤维8%~15% 、无氮浸出物30%~35% 、粗灰分8%~12% 、钙1%~3% 、磷0.3%~0.6% 。此外,桑叶中还含有多种维生素,每100g 桑叶中含有维生素C 30~40mg、维生素B 1 0.5~0.8mg 、维生素B12 0.8~1.5mg 、维生素E 30~40mg 、维生素B 11 0.5~0.6mg 、维生素B 5 3~5mg 。桑叶不仅必需氨基酸含量高,且氨基酸种类齐全,是优良的蛋白质资源和家畜饲料,能够满足家畜的正常生长发育需要;同时桑叶中的许多天然活性物质还具有抗应激、增强家畜机体的耐力和提高抗病能力 。桑叶微酸稍甜,对大多数家畜都有很好的适口性,且粗纤维含量低,易消化吸收,因此拓展桑叶的饲料用途,对于桑树产业的多元化和满足畜牧业快速发展对蛋白质饲料的需求具有十分重要的现实意义。鲜桑叶水分含量高,难以长期保存,而自然干燥对天气的条件要求高,特别是在南方多雨季节更不易实现,所以青贮是最为适宜的贮藏方式。青贮过程中通过微生物发酵不仅可以消除桑叶中抗营养因子及有毒物质对家畜产生的不良影响,还可以延长桑叶的饲喂期限,提高其利用率,也可作为家畜冬春季节蛋白质饲料的有效补充。桑叶作为一种非常规饲料,关于其青贮发酵品质的调控技术研究报道较少,所以本研究试图通过添加乳酸菌及发酵底物葡萄糖和糖蜜评价其对发酵品质的改善效果,探讨提高桑叶青贮发酵品质的有效措施。青贮饲料调制过程中添加乳酸菌可提高青贮原料中乳酸菌的数量和活性,使青贮早期迅速开始乳酸发酵,快速降低pH,抑制有害微生物的活性,提高发酵品质。在青稞(Hordeum   vulgare )秸秆和多年生黑麦草( Lolium  perenne )混合青贮中添加乳酸菌,加速了青贮早期乳酸发酵进程。 添加乳酸菌显著改善了全株玉米(Zea   mays ) TMR ( total mixed ration ,全混合日粮)的发酵品质,同时补充发酵底物葡萄糖、糖蜜可进一步提高发酵品质。Li等研究表明,王草(Pennisetum   purpureum × Penicillium   glaucum )青贮中添加葡萄糖和糖蜜均显著降低了 pH 值,提高了乳酸含量。原现军等在青稞秸秆与多年生黑麦草以6∶4 混合的基础上添加 3% 的糖蜜获得了发酵品质良好的青贮饲料。本试验旨在评价添加乳酸菌,葡萄糖和糖蜜对桑叶青贮发酵品质的改善效果,为生产优质桑叶青贮饲料提供理论依据和技术支撑,促进畜牧业的可持续发展。8 6 1 ACTA PRATACULTURAE SINICA ( 2016 ) Vol.25 , No.6 1  材料与方法1.1  试验材料桑叶取自安徽绿+硒农业生态科技发展有限公司(安徽省石台县),于2014年11月8日采收,采收时机为待新稍长至80cm 左右进行整株刈割,属当年第3茬刈割,留茬高度10~15cm ,去除枝条,保留叶柄和叶片。葡萄糖为 AR (分析纯)级,国药集团化学试剂有限公司生产;糖蜜为制糖业副产品,红褐色粘稠状液体,干物质含量51.3% ,水溶性糖含量68.4% (以干物质基础),主要成分为蔗糖;乳酸菌制剂主要成分为植物乳杆菌,由南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所研制。1.2  试验设计青贮窖采用实验室青贮窖,容积为10L的有内外盖的特制聚乙烯塑料桶。试验采用完全随机区组设计,设6个处理组:(1 )对照组( C ,无添加)。( 2 )乳酸菌组( P )。( 3 )葡萄糖组( G )。( 4 )糖蜜组( M )。( 5 )乳杆菌+葡萄糖组( P+G )。(6 )乳杆菌+糖蜜组( P+M )。其中糖蜜添加量为3%鲜重( fresh weight , FW ),葡萄糖添加量为1% FW ,乳杆菌添加水平为106 cfu / g  FW 。在青贮后第7 , 14 , 30和60天打开实验室青贮窖,分析青贮饲料各项指标,每个处理各个时间点3个重复。1.3  试验方法1.3.1  青贮饲料的调制    将新鲜采摘的桑叶用铡刀切成1~2cm 左右,按试验设计量将各添加剂添加到桑叶中,充分混合均匀后,逐层装填至10L实验室青贮窖中,人工压实后盖上内外盖,并用胶带密封,置于室温下保存。1.3.2  样品处理    按照试验设计在不同青贮时间点分别打开实验室青贮窖,取出全部青贮饲料充分混合均匀,采用四分法称取20g 放入100mL的广口三角瓶,加入60mL去离子水,4℃浸提24h ,然后通过双层纱布和滤纸过滤,将滤液冷冻保存于-20℃冰箱待测。滤液用来测定 pH 值、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸。将剩余的青贮饲料收集起来烘干,称重,测定干物质、总氮、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维。1.3.3  测定指标及分析方法 干物质(dry matter , DM )、粗蛋白( crude protein , CP )、粗脂肪( ether ex -tract , EE )和粗灰分( crude ash , Ash )采用 AOAC方法测定;中性洗涤纤维( neutral detergent fiber , NDF )和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber , ADF )采用范氏纤维测定,其中 NDF需加入耐高温 α 淀粉酶和亚硫酸钠;pH 用HANNA pH 211型 pH 计测定;缓冲能(buffer capacity , BC )用盐酸、氢氧化钠滴定法测定;水溶性碳水化合物( water soluble carbohydrate , WSC )采用蒽酮—硫酸比色法测定;氨态氮(ammonia nitrogen , AN )采用苯酚-次氯酸钠比色法测定;乳酸(lactic acid , LA )、挥发性脂肪酸( volatile fatty  acids , VFAs )和乙醇( alcohol )采用安捷伦1260高效液相检测系统,配备示差检测器, Carbomix? H - NP5色谱柱(测试条件:55℃ , 2.5mmol / L H 2 SO 4 , 0.5mL / min )。乳酸菌、好氧性细菌和酵母菌分别采用 MRS琼脂培养基、营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂培养基。乳酸菌用厌氧培养箱,30℃培养3d ;酵母菌和好氧性细菌用生化培养箱, 30℃培养3d 。1.4  数据处理与统计采用SPSS 20软件对试验数据进行单因子方差分析( ANONA ),并用Duncan方法对处理组间及青贮天数间平均数进行多重比较(P <0.05 )。2  结果与分析2.1  青贮前桑叶主要化学成分和微生物组成青贮前桑叶主要化学成分和表面附着微生物组成见表1和表2 ,青贮前桑叶原材料的干物质含量为384.70g/kg FW ,粗蛋白和水溶性碳水化合物含量分别为136.63g /kg DM 和117.49g/kg DM ,中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别为302.70g/kg DM 和156.80g/kg DM ,缓冲能为223.02mEq /kg DM 。2.2  添加剂对桑叶青贮过程中pH 值、干物质和有机酸含量的影响如表3所示,随着青贮的进行,各组干物质含量总体上呈下降趋势,但无显著变化。整个青贮过程中 M组干物质含量始终显示最高,而乳酸菌组最低,在青贮结束时 M 组干物质含量显著( P <0.05 )高于 C和 P组。添加乳酸菌促进了桑叶青贮过程中乳酸发酵,青表 2 显著( P <0.05 )高于对照组,而 M 组乳酸含量仅为对照组的2倍(P <0.05 ), G组略高于对照组。随着青贮的进行各组乳酸不断积累,其中乳酸菌及组合添加组( P , P+G和P+M 组)乳酸含量始终显著(P <0.05 )高于未添加乳酸菌组( C , G 和 M组)。 G组在青贮前30d乳酸含量略高于对照组,但差异不显著(P >0.05 ),之后快速上升,在青贮结束时显著(P <0.05 )高于对照组。 M 组乳酸含量始终显著( P <0.05 )高于对照组,但与 G 组无显著差异( P >0.05 )。相应地P组 pH 值在青贮第7天已降至4.30以下,之后继续保持较低水平直至青贮结束,其中 P+G 和 P+M 在青贮结束时降至4.0左右。对照组、 G和 M 组 pH 值在青贮前30d始终保持在5.85以上,青贮60d时对照组仍为5.96 ,虽 G和 M 组分别下降至5.35和5.24,但仍显著(P <0.05 )高于P组。整个青贮过程中P组乙酸含量始终高于C 、 G和 M 组(表3),但 C、 G 和 M 组间差异不显著( P >0.05 )。青贮第7天P 、 P+G和P+M 组乙酸含量达到17.01~19.65g/kg DM ,之后P组乙酸含量逐渐上升,并显著( P <0.05 )高于P+G和P+M 组直至青贮结束。在桑叶青贮过程中,各组仅检测出微量丙酸和丁酸,且各组间无显著差异( P >0.05 ),因此表中未列出。  添加剂对桑叶青贮过程中氨态氮/总氮、乙醇和水溶性碳水化合物含量的影响随着发酵的进行各组乙醇不断积累,青贮前14d ,对照组乙醇含量显著( P <0.05 )高于 P+M 组,之后对照组乙醇含量显著(P <0.05 )上升,并保持在较高水平直至青贮结束(表4 )。而 G 和 M 组乙醇含量显著上升出现在30d之后,青贮结束时显著(P <0.05)高于P、P+G和P+M 组。整个青贮过程中P 、 P+G 和P+M 组乙醇含量均呈较低水平,低于或显著(P <0.05 )低于 G和 M 组。各组 WSC含量随青贮时间的延长呈下降趋势,在青贮第7天添加乳酸菌的P 、 P+G 和P+M 组 WSC含量显著( P <0.05)低于C、 G和 M 组。在整个青贮过程中P组 WSC含量始终维持最低值,但与P+G 和P+M 组始终无显著差异(P >0.05 ),同样地 G和 M 组在青贮14d后 WSC含量与对照组差异不显著( P >0.05 )。 青贮第7天 P组氨态氮/总氮已显著( P <0.05 )低于对照组,而P+G和P+M 组氨态氮/总氮均略低于( P >0.05 )P组。之后各组氨态氮/总氮均随青贮时间的延长逐渐上升,其中 P 、 P+G 和 P+M 组氨态氮/总氮保持较低水平(P <0.05 )直至青贮结束,而 G和 M 组 氨 态 氮/总 氮 与 对 照 组 无 显 著 差 异 ( P >0.05 )。2.4  添加剂对桑叶青贮饲料粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的影响青贮60d后各组粗蛋白含量无显著差异,添加乳酸菌的P 、 P+G和P+M 组中性洗涤纤维含量均显著(P <0.05)低于C、 G和 M 组。与对照组相比,P组酸性洗涤纤维含量有所下降但差异不显著( P >0.05 ),而P+G组和P+M 组的酸性洗涤纤维含量显著低于 青贮 60d 后添加剂对桑叶粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量的影响。3  讨论3.1  添加乳酸菌和发酵底物对桑叶青贮饲料发酵品质的影响本试验桑叶青贮采用实验室青贮窖模拟生产用青贮窖,密封性能良好,青贮过程中流汁、气体损失少,因此各组青贮过程中干物质含量无显著变化,总体上仅有少量的下降。桑叶原材料表面附着的乳酸菌数量为6.73log 10 cfu/ g FW ,与玉米( 6.44log 10 cfu / g  FW )、紫花苜蓿( Medi -cago   sativa )( 6.5log 10 cfu / g  FW )附着的乳酸菌数量相当〔 12 - 13 〕 ,但对照组青贮前7d未见大量乳酸生成,而P组,P+G组和P+M 组青贮第7天乳酸含量已达到对照组的6倍以上,pH 值降至4.27以下,表明添加乳酸菌促进了乳酸发酵,降低了 pH 值,明显改善了桑叶青贮发酵品质,这可能是由于桑叶本身附着的乳酸菌数量尽管较多,但活性不强,产乳酸能力较弱。有研究表明植物表面附着的乳酸菌大多数为球菌,80%为明串珠菌属,乳酸杆菌仅占很少的一部分  。本试验中添加的乳酸菌为植物乳杆菌,是兼性同型发酵乳酸菌,发酵底物广泛,产酸能力强,因此促进了乳酸发酵 。葡萄糖添加组青贮前30d乳酸含量与对照组无显著差异,虽然糖蜜添加组乳酸含量始终显著高于对照组,但青贮结束时 G和 M 组乳酸含量仅达到51.55和43.32g/kg DM , pH 值青贮前30d均保持在5.85以上,青贮结束时仅分别降至5.35和5.24 ,表明本试验中补充发酵底物对改善桑叶青贮发酵品质的效果不及添加乳酸菌,青贮结束时,各组具有较高含量的水溶性碳水化合物剩余,因此认为影响桑叶青贮发酵品质的主要限制性因素是缺少高活性、产酸能力强的乳酸,添加乳酸菌比添加发酵底物更重要。乳酸菌单独添加组乙酸含量始终高于对照组,其中前30d显著高于对照组,这可能是添加的植物乳杆菌为兼性异型发酵乳酸菌,在发酵过程中既可以利用六碳糖产生2分子乳酸,也可以利用五碳糖为底物发酵形成 D -木糖 - 5 - 磷酸盐中间产物,进而生成乳酸和乙酸 。 Parvin 和Nishino 报道 L .plantarum 与 L . pentosus 相似均属于兼性异型发酵乳酸菌,可以将 1 分子戊糖代谢生成 1 分子乳酸和 1 分子乙酸。 Avila等  也报道,青贮饲料中接种乳酸菌的发酵产物主要为乳酸,但在一些情况下也可产生更多的乙酸,这是由于接种的乳酸菌可以通过调节自身的代谢途径来适应不同的青贮环境,兼性异型发酵乳酸菌在糖分相对充足的厌氧条件下,通过糖酵解途径以果糖 - 1 , 6 - 二磷酸和丙酮酸为中间产物最终产生乳酸,而在葡萄糖相对短缺的情况下能以戊糖磷酸化途径、经过脱氢和脱羧作用最终生成CO 2 、乙醇或乙酸等终产物。这一点也可以通过P+G和P+M 组得到证实:与单独添加乳酸菌相比,同时添加发酵底物组( P+G和P+M 组)有较高的乳酸和较低的乙酸含量。乳酸菌单独添加组乙醇含量始终低于对照组,这是由于 P 组有较低的pH值能够有效地抑制肠杆菌和酵母菌等产乙醇的微生物活性,因此降低了乙醇含量,组合糖蜜或葡萄糖添加加速了 pH 的下降,从而进一步抑制了乙醇的生成 。2 7 1 ACTA PRATACULTURAE SINICA ( 2016 ) Vol.25 , No.6 3.2  添加乳酸菌和发酵底物对桑叶青贮饲料养分含量的影响乳酸菌单独添加组青贮第7天 WSC含量已经显著低于对照组,表明接种乳酸菌后,青贮早期有旺盛的乳酸发酵,消耗了大量的 WSC ,这一点与该组有较高的乳酸含量相一致。青贮饲料中氨态氮主要由植物酶对蛋白质的降解和微生物分解利用蛋白质和氨基酸产生 ,氨态氮/总氮反映了青贮饲料蛋白质降解的程度。乳酸菌添加组均保持较低的氨态氮/总氮,且P+G和P+M 组显示更低的氨态氮/总氮,这是由于接种乳酸菌加速了乳酸的产生,促进了 pH 值的下降,进而抑制了青贮过程中植物蛋白酶和微生物对蛋白质和氨基酸的降解作用,减少了氨态氮的产生 。 Zhang 等 报道,四倍体刺槐(Robiniapseudoacacia )青贮中快速降低 pH ,可以有效地抑制因有害微生物的增殖对蛋白质的降解,从而有效地降低了氨态氮的生成。乳酸菌组中性洗涤纤维含量显著低于对照组,可能是由于较低的 pH 形成的酸性环境促进了细胞壁成分的酸解作用。4  结论本试验单独接种乳酸菌加速了桑叶青贮过程中乳酸的产生,快速降低了 pH 值,获得了良好的发酵品质,而添加糖蜜和葡萄糖青贮60dpH 值均保持在5.0以上。与单独添加乳酸菌相比,组合添加对桑叶青贮饲料发酵品质改善效果不明显。从经济角度出发建议,在桑叶青贮中单独添加含有植物乳杆菌的添加剂也能获得优质青贮饲料。

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