福建水产设备联盟

利用酵母双杂筛选与APP胞外域互作的蛋白

欧易生物 2019-03-14 14:56:08

背景介绍

  • 阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统变性病,以老年斑(主要有β-淀粉样蛋白沉积形成)在大脑中广泛分布为特征病理。β-淀粉样蛋白由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)通过蛋白酶解加工产生的。APP是有长胞外域和短胞内域的I型跨膜蛋白,与细胞粘附和轴突导向等许多细胞过程相关。尽管AD的病因及发病机制尚未阐明,但通过对APP功能的干扰可能有助于疾病过程。

  • 研究APP功能的一个重要方法是探究能与其结合的分子。目前,已经发现许多蛋白,如F-spondin,apolipoprotein E,Fe65,和JNKinteracting protein 1等都与APP有相互作用。APP的结构表明它可能是有作为细胞受体的功能。然而,由于不知其结合蛋白,人们仍无法完全了解APP的生理学功能。因此,寻找APP的可能配体对于揭示其生理和病理学功能至关重要。

  • 利用酵母双杂技术可以探索未知的蛋白质之间的相互作用,因此本文以APP695的胞外域作为诱饵来鉴定其可能的结合蛋白。


结果分析

1、APPex-pGBKT7质粒的表达、自激活和毒性检测

将Gal4 DNA-BD与pGBKT7-53编码的小鼠p53融合,Gal4 AD与pGADT7-T编码的SV40 large T-antigen融合。Y2HGold [pGBKT7-53]和Y187 [pGADT7-T]杂交形成的质粒可以激活报告基因,使酵母在SD-Leu/Trp/His/Ade和aureobasidin A (QDO/X/A) 培养基中生长。此外,以pGBKT7-Lam和pGADT7-T杂交作为阴性对照。结果发现,阳性对照中QDO/X/A平板上有蓝色菌落,而阴性对照中没有,表明QDO/X/A平板可以用于后续的酵母双杂筛选(Fig.1a)。APP的编码序列包含2088碱基对,编码信号肽、胞外域、跨膜域和胞内域,其中52-1872bp编码胞外域,将这段序列克隆到pGBKT7载体上,构建APPex-pGBKT7质粒(Fig.1b)。将质粒APPex-pGBKT7转化至Y2HGold菌株中进行培养,以检测其表达、自激活和毒性。

首先,在SD-Trp平板上培养并提取酵母蛋白,利用Western blotting检测其表达情况,结果与预估值(89 kDa)一致(Fig.1c)。其次,毒性评估表明质粒APPex-pGBKT7基本没有毒性(Fig.1d)。最后,在SD-Trp/X,SDTrp/X/A和SD-Trp/His/Ade/X/A平板上培养Y2HGold菌株,发现SD-Trp/X和SDTrp/X/A平板上均有蓝斑,表明APPex-pGBKT7在该条件下能自激活,但是在SD-Trp/His/Ade/X/A平板上无细菌生长,表明APPex-pGBKT7在该条件下不具有自激活功能(Fig.1e)。

Figure 1. Control experiment, cloning and testing APPex-pGBKT7 for toxicity and autoactivation. (A) Control experiment. The red circles indicated the colonies. (B) The structure of APPex-pGBKT7 bait clone. (C) Testing expression of APPex-pGBKT7 in Y2HGold strain. (D) Testing toxicity of APPex-pGBKT7 in Y2HGold strain. (E) Testing autoactivation of APPex-pGBKT7 in Y2HGold strain on three kinds of plates. The red circles indicated the colonies.


2、用Mating法筛选cDNA文库

将诱饵质粒APPex-pGBKT7与cDNA文库共培养,5天之后从QDO/X/A 平板上得到192个克隆,然后将蓝白菌落分开培养以获得纯的蓝色菌落,并回收这192个cDNA质粒。然后将cDNA质粒和APPex-pGBKT7共转到Y2HGold中。192个质粒中有77个阳性,对其测序发现有9个跨膜蛋白,其中只有TMEM30A可以与APP结合。

Fig. 2. Screened products of APPex-pGBKT7. A. QDO/X/A plates co-transformed with APPex-pGBKT7 and its screened products. The red circles indicated yeast colonies. B. Gene and protein names of screened products.

 

3、在哺乳动物体内验证相互作用

利用Co-immunoprecipitation(Co-IP)验证APP与筛选到的蛋白之间的相互作用。

设计full-length APP以表达其C-端的mCherry(APP-mCherry),同时设计mutated full-length PLP1, full-length FLRT3和full-length KCTD16用于表达EGFP (enhanced green fluorescent protein)。将APP-mCherry和mPLP1-EGFP 共转染到HEK293T细胞中培养,并进行Co-IP,在其混合物中检测到了mCherry和EGFP,表明mutated PLP1可以与APP互作,但wild-type PLP1无法与APP结合。同样地,KCTD16-EGFP和FLRT3-EGFP也可以与APP-mCherry互作。Co-IP结果表明FLRT1在HEK293T细胞中与APP相互作用。(Fig.2)

Fig. 2 Co-immunoprecipitation of full-length APP with full-length PLP1, full-length KCTD16, and full-length FLRT in HEK293T cells.


有研究发现FLTR3可促进培养的神经元的轴突生长;PLP1是一个在髓磷脂的形成和维持中其作用的多重跨膜蛋白,PLP1基因突变会导致中枢神经系统的髓鞘形成障碍;APP可以调节轴突导向。因此,为了检测APP的胞外域是否可以与FLTR3和PLP1的胞外域互作,将两者的胞外域克隆转染到HEK293T细胞中。结果发现APP的胞外域可以与FLTR3的胞外域相互作用,因此,FLRT3的胞外域可能是通过与受体APP结合而起到向导作用。以上结果表明FLRT蛋白家族通过与APP结合来参与细胞过程(轴突导向和突触发育等)。但APP在上游还是下游过程起作用还有待进一步研究。此外,mutated FLRT1胞外域也可以与APP胞外域结合,从而影响少突胶质细胞的形成以及PMD中髓磷脂鞘的形成和维持。

Fig. 3 Localization of ectodomain proteins in HEK293T cells. HEK293T cells were transfected with ecto-FLRT3-EGFP

Fig. 4 Co-immunoprecipitation of the APP extracellular domain with the FLRT3 extracellular domain or the mPLP1 extracellular domain in HEK293T cells.

 

总结

本文利用酵母双杂来鉴定了与APP胞外域结合的3个蛋白,并利用哺乳动物验证了其相互作用,发现mutated PLP1,FLRT蛋白家族和KCTD16均与APP有相互作用。这些蛋白已经被报道与PMD和轴突导向(axon guidance)有关。因此,本研究揭示了APP在AD,PMD,和axon guidance中的生理学功能和作用机制。


参考文献

You Y, Li Y, Yan Z. Yeast Two-Hybrid Screening for Proteins that Interact with the Extracellular Domain of Amyloid Precursor Protein[J]. Neuroscience Bulletin, 2016, 32(2):171-176.


-拓展阅读-

 点击图片查看

-END-

宋雪迎 撰文

TC 、一棵麦子 整理编辑

本文系欧易生物原创

欢迎转发到朋友圈

转载请注明本文转自欧易生物