基于蛋白结构和底物库动力学谱的酶蛋白质工程改造策略

在国家973计划课题（2011CB710802）、国家自然科学基金项目（21376107）、国家“万人计划”青年拔尖人才计划项目资助下，江南大学生物工程学院酿造微生物学与应用酶学研究团队在基于蛋白结构和底物库动力学谱拓宽立体选择性醇脱氢酶底物普适性方面的研究取得进展。相关研究成果以“Enzyme engineering based on X-ray structures and kinetic profiling of substrate libraries: alcohol dehydrogenases for stereospecific synthesis of a broad range of chiral alcohols”为题于2018年4月发表在ACS Catalysis杂志（影响因子10.614），徐岩教授为文章通讯作者，聂尧教授和江南大学已毕业博士研究生王珊珊为文章共同第一作者。

手性醇是合成医药中间体和精细化学品的重要手性模块化合物。醇脱氢酶功能催化潜手性羰基化合物不对称还原合成手性醇，具有高化学、区域和立体选择性等显著特点。然而，醇脱氢酶应用于大规模化催化手性醇合成时，大多数情况下，潜手性羰基化合物并非其天然最适底物，野生型醇脱氢酶普遍存在底物谱有限的问题，而显著限制其作用于不同结构羰基化合物底物的应用范围。因此，改造野生型醇脱氢酶，提高对非天然底物的特异性和稳定性，扩展多种高附加值产品的合成能力，获得人类所需的高效醇脱氢酶具有重大的应用价值，也是酶工程的重要挑战。酶的底物谱的大小决定了酶在工业生产中的适用性能力。扩展酶的底物谱，使酶具有多功能的催化活力是研究的热点。

通过对芳香酮、β-酮酯和脂肪酮类共24种羰基化合物的动力学参数的测定，明确了立体选择性醇脱氢酶RCR的底物特异性规律：对于空间体积较小的底物有较好的催化性能，而对于含大取代基的底物，催化活力明显下降。基于立体选择性醇脱氢酶RCR分别结合辅酶（RCR-NAD+，PDB ID：3WLE）、产物（RCR-(R)-PED，PDB ID：3WLF）、底物（RCR_H49A-HAP，PDB ID：3WNQ）的复合物晶体结构，根据RCR底物结合口袋所组成的氨基酸位点进行分析，设计大口袋处的突变，构建突变体W116A。对比野生型酶，突变体W116A对较大底物的催化性能有了很大的提高，如对苯乙酮衍生物（2a-7a）的活性提高到原来的1.8~13.8倍，β-酮酯类底物16a、18a和19a提高了近20倍以上，并且不影响酶的立体选择性。小口袋处的双突变体F285A/W286A除了对小底物如1a、8a、10a、13a、14a、24a的催化活力有所降低，对所检测的其它底物催化效率也有不同程度的提高，其立体选择性发生了不同程度的改变甚至反转。分子对接模拟模型进一步解释了突变体的底物特异性和立体选择性改变的分子机制。天然酶与突变体酶的底物谱互补性提高了ADH转化体系中应用性能。

野生型醇脱氢酶较窄的底物谱严重限制了其在手性醇合成中的应用范围。基于酶蛋白复合物晶体结构和酶催化底物库的动力学谱，理性设计了立体选择性醇脱氢酶的突变体。获得的四个突变酶显著拓宽了酶的底物谱范围，适用于更多重要医药中间体的不对称合成。本研究发展的蛋白质工程改造策略为创造更多合成结构复杂手性醇的醇脱氢酶提供了研究基础。