pull-down技术——钓出RNA和蛋白质的关系

2023-05-10 14:56:27

     后基因组时代，RNA的研究变得日益频繁，每一个生物研究者或多或少都会接触RNA或RNA结合蛋白的研究。本期将介绍RNA研究中的一项实验技术Pull Down 技术。

下面具体展开Pull Down 技术的介绍


概览

   Pull Down主要有GST-pull-down和RNA/DNA pull-down


 GST-pull-down


    利用GST融合蛋白沉降技术，将靶蛋白与GST标签蛋白进行融合表达，纯化获取融合表达蛋白。靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的反比亲和的支撑物，充当诱饵蛋白，目的蛋白溶液过柱纯化，即可捕获与之相互作用的俘获蛋白，洗脱结合物，通过SDS-page电泳分析，或联用WB和MS检测，可验证蛋白间的相互作用或筛选获取相应的目的蛋白。

 RNA/DNA pull-down


   RNA/DNA Pull down是检测RNA/DNA结合蛋白与其靶RNA/DNA之间相互作用的主要实验手段之一。用生物素标记RNA/DNA 探针，与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA/DNA—蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA/DNA结合蛋白是否与RNA/DNA相互作用，还可以对该蛋白进行质谱（MS）鉴定蛋白质类型.


 RNA/DNA pull-down图解



主要流程

GST-pull-down

构建GST-靶蛋白融合表达载体 WB检测融合蛋白的表达 获取总蛋白裂解液 GST-pull-down调取互作结合蛋白 对结合蛋白进行纯化与分析


RNA/DNA pull-down

RNA/DNA生物素探针制备 细胞裂解液制备 .获取总蛋白裂解液 pull-down调取互作结合蛋白 对结合蛋白进行纯化与分析


三种技术对比

GST-pull down

通过磁珠结合捕获，形成复合体形式，更加灵敏和针对性获取结合蛋白：磁珠与GST抗体孵育结合，通过与样品裂解液孵育，形成磁珠-GST抗体-GST融合蛋白-互作结合蛋白综合体，进而纯化获取目的结合蛋白.

RNA pull down

根据基因序列进行DNA序列T克隆，做外转录成RNA，再进行生物素标记，与细胞裂解液结合分离结合蛋白。

DNA pull down

可以直接合成生物素标记DNA探针，与细胞裂解液结合，磁珠法筛选分离离结合蛋白。


一般外包需要提供的信息

GST-pull-down

提供样品

1) 已验证含有融合蛋白表达的样品（验证表达融合蛋白的WB结果图）
2) 可用于WB检测和IP实验的GST标签抗体

RNA/DNA pull-down

提供样品

1) 需检测的细胞样品

提供信息
1) 目的基因信息；
2) 目的蛋白信息；
3) 一抗及其说明书


总结

pull-down技术主要通过标签作为桥梁，连接蛋白质（目标蛋白）与磁珠（捕获固定作用）来捕获目标蛋白，多用于研究RNA-蛋白质作用。

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