基于质谱和DNA模板探针鉴定适配子靶蛋白

毕文静，柏雪，田姗姗，翟贵金，张锴^*

（天津医科大学，天津市医学表观遗传重点实验室，天津，300070）

摘要：以溶菌酶为模型，发展了新型的基于DNA模板和光交联的适配子结合蛋白的鉴定方法。探针具有良好的选择性和较高的灵敏度，可以实现复杂背景干扰下对目标蛋白溶菌酶的亲和富集。结合质谱的定性鉴定，探针在适配子相关的生物标志物的发现方面具有潜在的应用价值。

关键词：液相色谱—质谱，核酸适配体，DNA模板，光交联

适配子是一段单链DNA或RNA，具有一定的空间结构，可以特异性地识别蛋白、小分子以及复杂的细胞。适配子具有稳定性好、易改造修饰、快速合成的优点，以其为识别系统，构建分子探针，在某些疾病标志物的发现方面可以媲美抗体的作用。

基于适配体识别的“fishing”方法可用来识别疾病细胞的生物标志物^[1]，由于适配体与目标物之间作用力较弱且动态变化，这一方法的应用受到一定的限制。在适配子上附加光交联基团可以将弱的相互作用转化为共价键^[2]，但是在适配体骨架上直接进行修饰可能改变适配体结构，进而影响其识别。最近有报道指出DNA模板控制技术作为辅助工具在蛋白相互作用鉴定中的应用取得较好的成果^[3-5]。在本研究中，我们以溶菌酶及其适配子为模型，将DNA模板技术与适配体探针相结合，发展了新型的适配体-蛋白相互作用分析方法。如图1，探针设计为BP和CP双探针系统，BP（binding probe）包含两部分：适配体和一段单链DNA。CP（capture probe）为一段互补的单链DNA、两端分别修饰光交联基团和报告基团。鉴定概括为五步：1）适配体与靶标结合；2）CP/BP杂交；3）紫外光照引发交联；4）荧光成像或者亲和富集；5）目标蛋白质谱鉴定。DNA杂交将光交联基团快速的引入，在保留适配子原始结构的同时，将靶标共价键合到探针上，因而可以提高后续的鉴定效率。

 

图:1：基于DNA模板技术的适配体探针研究适配体蛋白相互作用流程

Fig 1: Protocol of DNA templated aptamer probe for studying aptamer-protein interaction.

1实验部分：

1.1 仪器与试剂：

纳升级液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（QE，美国Thermo-fisher公司），MALDI-TOF质谱仪（AutoflexIII LRF200-CID，德国Bruker公司），垂直平板凝胶电泳仪（美国Bio-RAD公司）。实验所用DNA序列：5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG ATG TCG CTG TAG-3’、5’ FAM-TTT TTT CTA CAG CGA CAT TTG-C6-NH2（上海生工生物技术有限公司）。

1.2 探针合成

CP探针由氨基修饰的DNA与含NHS的交联剂通过酰胺化反应连接得到。将反应物按交联剂：DNA=20:1的比例于NaHCO₃（pH=8.5）缓冲液中室温反应1 h，产物通过冰乙醇沉淀的方式进行提纯，适量的超纯水溶解后存放在-20℃备用。

1.3溶菌酶的亲和富集和质谱鉴定

取适量的溶菌酶与BP于4℃孵育过夜。向孵育后的溶液中加入生物素修饰的CP，室温孵育1h后，冰上紫外光照8 min，引发光交联反应。将溶液转移至盛有预先用 PBS缓冲洗过的链霉亲和素琼脂糖 beads 的离心管中，置于4 ℃孵育 4 h，低速离心，beads 用缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.4、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.01% Triton X100）洗3次后，向 beads 中加入适量体积的蛋白加样缓冲液，95 ℃加热10min，室温低速离心，上清SDS-PAGE 表征，凝胶进行银染显色，以观察探针富集的效果。

2. 结果与讨论

2.1探针合成表征

合成的探针通过MALDI-TOF质谱仪进行分子量表征。由图2可以看出，主峰分子量与理论分子量相符，说明探针合成正确且合成效率较高，可以用于后续实验使用。

 

图2：CP探针质谱表征，理论分子量为7075.3。

Fig 2: MALDI-TOF MS Characterization of the DNA probe. Theoretical molecular weight is 7075.3.

2.3适配体探针对目标蛋白的亲和富集和质谱鉴定

利用基于DNA模板的适配子探针，分别在纯溶菌酶和复杂背景条件下对目标蛋白进行了亲和富集，富集捕捉的蛋白通过SDS-PAGE分离，由图3，发现蛋白条带分子量匹配正确。初步判断为溶菌酶。为了进一步确定目标蛋白，将目标条带切下进行质谱表征，MS/MS结果显示，此条带为溶菌酶。 

图3：基于DNA模板的适配体探针富集溶菌酶。泳道1：蛋白Marker；泳道2 ：溶菌酶；泳道3：探针在2背景下富集的溶菌酶；泳道4：Hela全蛋白和溶菌酶；泳道5：探针在4背景下富集的溶菌酶。

Fig 3: Affinity pull-down of lysozyme by DNA-templated aptamer probe. Lane 1, marker; lane 2, lysozyme; lane

3, lysozyme enriched from sample shown in lane 2; lane 4, lysozyme mixedwith Hela cell lysates; lane 5, lysozyme enriched from samples shown inlane 4.

图4: 目标蛋白溶菌酶的特征多肽。

Fig. 4:The unique peptides of lysozyme identified by HPLC-MS/MS.

3 结论

本研究将传统的适配体探针与DNA模板和光亲和交联技术结合，发展了新型的研究适配子-蛋白相互作用的分析方法。以溶菌酶及其特定适配子为研究模型，我们验证了探针对目标蛋白溶菌酶具有较好的富集效果，并且具有良好的选择性。结合质谱的定性鉴定，该方法在研究适配子及其互作蛋白以及生物标志物的鉴定方面具有潜在的应用价值。

 

参考文献：

[1]Leppek, K.; Stoecklin, G.Nucleic Acids Res.2014, 42, e13.

[2]Vinkenborg, J. L.; Mayer, G.; Famulok, M.Angew. Chem., Int. Ed.2012, 51, 9176−9180.

[3] Li, G.; Liu, Y.; Liu, Y.; Chen, L.; Wu, S.; Liu, Y.; Li, X.Angew.Chem., Int. Ed.2013, 52, 9544−9549.

[4] Liu, Y.; Zheng, W.; Zhang, W.; Chen, N.; Liu, Y.; Chen, L.;Zhou, X.; Chen, X.; Zheng, H.; Li, X.Chem. Sci.2015, 6, 745−751.

[5] Bai, X.; Lu, C.; Jin, J.; Tian, S.; Guo, Z.; Chen, P.; Zhai, G.;Zheng, S.; He, X.; Fan, E.; Zhang, Y.; Zhang, K.Angew. Chem., Int. Ed.2016, 55, 7993−7997.

 

Combining Mass Spectrometry Analysis and DNA Self-assembly Probe for Identification of Proteins Targeted byAptamer

Bi Wenjing, Bai Xue,Tian Shanshan, Zhai Guijin, Zhang Kai^*

(Tianjin Key Laboratory of Medical Epigenetics, Tianjin Medical University, Tianjin 300070)

Abstract:Using lysozyme as a model, we developed an aptamer based DNA-templated chemistry and photo-cross-linking techniquefor the identification of target proteins that are recognized byaptamers. Thisprobe can be utilized for a successfulenrichment of target proteineven under a complicatedenvironment. Combining with mass spectrometry, this probe has a potential application for discovery of aptamer-based biomarkers.

Keywords: HPLC-MS, aptamer, DNA templated technology, photo-crosslinking