【发酵工程】谷氨酸发酵过程膜偶联间歇透析发酵工艺

2023-05-10 14:56:27



谷氨酸作为目前世界上产量最大的人类所需的重要氨基酸,在食品、医药以及工农业等方面有着广泛而重要的应用,尤其应用于食品调味剂味精的制作。谷氨酸经历了提取法、酶法和微生物发酵法等生产方法,微生物发酵法由于存在多种优势,成为谷氨酸的主要生产方法。谷氨酸发酵法是典型的代谢控制发酵,是工业微生物发酵工艺与过程控制的典型代表。

通过对谷氨酸生产菌种的代谢改造、培养基优化、发酵工艺与过程控制研究、新型生物反应器的研制以及分离提取工艺优化等方面的研究 与改进,谷氨酸产量和糖酸转化率得到了较大的提高。尽管如此,由于在发酵过程中玉米浆、豆粕水解液和糖蜜的应用,使得发酵液粘度大、色泽深、杂质多,造成发酵过程控制和分离提取比较困难;另一方面,胞外谷氨酸浓度较高时会对胞内谷氨酸的继续分泌产生抑制作用,这就造成胞内谷氨酸的积累,进而产生谷氨酸的反馈调节作用,抑制了谷氨酸脱氢酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶等的活性,使谷氨酸代谢流量降低,副产物增加,这都降低了谷氨酸的糖酸转化率及产量。再者,发酵中后期时,发酵液中的副产物和有毒有害物质增多, 降低发酵周期,也不利于谷氨酸的继续发酵。


膜偶联间歇透析发酵方法

即在谷氨酸普通发酵的基础上,将发酵罐与陶瓷膜相偶联,发酵一定时间后,将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离,将透析清液排出,把浓缩菌浆打回发酵罐, 同时向发酵罐中补加透析培养基继续发酵,重复以上步骤直至菌体活力变弱,本研究进行两次透析处理。 通过对谷氨酸膜偶联间歇透析发酵工艺的研究发现, 此工艺不但能够提高谷氨酸产量和糖酸转化率,同时也改善了发酵液的质量,提高了发酵效率。


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膜偶联间歇透析发酵工艺

膜偶联间歇透析发酵工艺可以解除发酵过程中谷氨酸的反馈调节作用以及降低副产物乳酸等的合成,同时减小有毒有害物质的抑制作用等。发酵过程中实时检测谷氨酸合成速率及副产物合成速率,到产酸速率降低时,进行膜透析处理(18h),分离发酵清液,之后补加无菌透析培养基继续发酵,34h进行第二次透析处理,继续发酵至50h。膜分离时间不计入发酵时间,整个过程维持正压。谷氨酸膜偶联间歇透析发酵装置如图1所示。


实验结果


膜偶联间歇透析发酵对菌体生物量及谷氨酸产量的影响



谷氨酸棒杆菌作为谷氨酸生产菌,具有较强的产酸能力单个菌体产酸效率高。谷氨酸发酵过程中,并不需要很大的菌体生物量,也能实现高产酸的目标。由图2可知,普通发酵生物量与透析发酵生物量差别较小,主要是由于不同批次发酵玉米浆等所引起的差异。透析发酵生物量的波动,可能与透析处理时少量菌体死亡,部分菌体溶解,而又有少许菌体生长有关。因此,透析发酵对谷氨酸棒杆菌几乎没有影响。

从图3可以看出,谷氨酸在发酵至18h时,产酸速率开始下降,对普通发酵来说,到30h左右时,产酸速率降低,34h时产酸速率明显降低。而对于透析发酵,在产酸速率开始下降的时候(18h左右)进行陶瓷膜的透析处理,将发酵清液分离出来,然后往浓缩的菌浆中补加透析培养基继续发酵。可以看出,透析发酵时没有产酸抑制期,产酸速率较高,而且第二次透析发酵(34h 进行透析处理)仍能维持高产酸速率。计算可得,普通发酵单罐产酸2.688kg,透析发酵单罐产酸5.232kg,单罐谷氨酸产量提高了94.64%同时发酵周期延长了16h 左右。


膜偶联间歇透析发酵对糖酸转化率的影响


氨基酸的工业化生产中,不但注重产酸量,更注重的是糖酸转化率, 糖酸转化率的高低反映了发酵水平的高低,也是生产效益的体现。


因此,糖酸转化率便成为生产中的重要指标。由图4可以看出,对于普通发酵,发酵前期由于延滞期的存在糖酸转化率较低, 随着菌体的转型和产酸的增强,糖酸转化率也不断上升,但仅有66%左右。到了发酵中后期,由于胞外高浓度谷氨酸所产生的高渗透压,使得胞内谷氨酸难以继续分泌,由此便产生的反馈调节,降低了菌体活力;另外,发酵中后期所产生的有毒有害物质也使菌体活力下降,糖酸转化率也相应地下降,到了34h左右产酸下降,糖酸转化率也有所下降。相反,对于透析发酵来说,待到18h左右糖酸转化率开始下降的时候, 进行透析处理,将发酵清液分离,同时也把有毒有害等物质分离,使得谷氨酸所产生的反馈调节作用被解除,毒害物质的副作用也消除,补加透析培养基后,菌体仍可以维持较高的活力, 糖酸转化率也维持在较高的水平,二次透析(34h)后依然有很高的转化率。经计算发现,普通发酵的总糖酸转化率为66.3%,而透析发酵的总糖酸转化率为69.8%,提高了3.5%。


膜偶联间歇透析发酵对过程控制及提取的影响


由于普通发酵培养基中大量使用玉米浆、豆浓和糖蜜这些色素含量多、杂质多和粘度大等的物质,致使培养基的粘度较大,发酵过程中易起泡,难于控制,同时还影响动量、热量和质量的传递,造成设备的过度损耗。而对透析发酵来说,由于透析培养基中并没有玉米浆、豆浓和糖蜜,因此发酵液澄清度高。透析发酵的培养基透光好,粘度低,不易起泡,三传效率高,设备的损耗也较小,降低了生产成本。具体透光值见表1。正是由于这些优势,透析所得的发酵

清液的质量较好,不但粘度低,杂蛋白少,色素也很少,因此在分离提取谷氨酸时,不但降低了提取的难度,而且所得谷氨酸产品中灰分含量很低,使所得谷氨酸的纯度也得到了提升。最终降低了生产成本,提高了经济效益。

膜偶联间歇透析发酵对谷氨酸代谢流及副产物的影响


导致代谢流量及副产物的变化的根本原因是相关酶活的变化。对于普通发酵而言,当发酵进入中后期时,由于谷氨酸在胞外的大量积累,使胞内合成的谷氨酸难以继续分泌, 而此时高溶度的谷氨酸便产生了对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用和对柠檬酸合成酶阻遏作用, 使得α-酮戊二酸难于合成谷氨酸,同时草酰乙酸便得到积累,进而转向合成天冬氨酸,天冬氨酸进一步合成副产物赖氨酸;另外,由谷氨酸和天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶产生的协同反馈阻遏作用使得磷酸烯醇式丙酮酸得到积累,它便进一步转化为丙酮酸, 由丙酮酸又生成较多的副产物乳酸和丙氨酸。而对于透析发酵,由于高浓度谷氨酸的及时分离, 其所产生的反馈调节作用便得到解除,使谷氨酸的高合成速率继续维持,草酰乙酸几乎没有积累,副产物赖氨酸也有所下降;又由于丙酮酸的合成速率下降及消耗速率增加, 因此它所产生的副产物乳酸和丙氨酸明显下降。 分别测定第一次透析发酵后期(28-32h)及第二次透析透析发酵后期(44-48h)的葡萄糖消耗速率,以及胞外谷氨酸、乳酸、丙氨酸和赖氨酸的积累速率,结果见表2。

然后以葡萄糖摩尔消耗速率为100mmol/(L·h),分别计算消耗或积累速率利用 Matlab 软件线性规划计算得到相应的代谢流分布,结果见图5。普通发酵代谢流分布如图6所示。根据图中代谢流分布,经计算可知, 主要代谢副产物乳酸的代谢流平均降低

了28.1%,丙氨酸的代谢流平均降低了20.0%,而目的产物谷氨酸的代谢流由 73.47提高至76.45(两次透析的平均值),提高了4.1%。由此可知,膜偶联间歇透析发酵不但能够降低副产物代谢流量、 提高目的产物的代谢流量, 而且还维持较高的目的产物代谢流量 (第一次和第二次透析后的代谢流量都很高且稳定)。

用膜偶联间歇透析发酵工艺, 在普通发酵中后期,产酸速率开始下降,谷氨酸反馈调节作用明显时,使用陶瓷膜分离清液,之后补加无菌透析培养基继续进行透析发酵。 透析处理能及时地将谷氨酸、毒害物质及副产物等与菌体分离,解除了谷氨酸的反馈调节,恢复了相关酶活力,使谷氨酸以较高的速率合成,同时降低了乳酸等副产物的合成,另外由于透析培养基中无玉米浆、糖蜜等,使发酵过程控制及谷氨酸分离提取都更加容易。


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