如何用蛋白组学的手段来研究microRNA

产品类型：相对定量蛋白质组学（iTRAQ）& micro RNA microarray  

英文题目：MiR-542-5p is a negative prognostic factor and promotes osteosarcoma tumorigenesis by targeting HUWE1

中文题目：MiR-542-5p是一种阴性预后因素，其通过靶向HUWE1促进骨肉瘤肿瘤发生

样品类型：骨肉瘤细胞系，骨肉瘤临床样本

微小RNA（microRNAs，miRNA）是一类广泛存在于真核生物的、长度约18～24个核苷酸的高度保守的内源性、非编码、单链小分子RNA。通过干扰mRNA翻译过程即碱基互补配对方式来调节靶基因的表达，对体内细胞增殖、分化、损伤、凋亡等发挥作用。

一般而言，一篇microRNA的研究内容，主要包括这几个部分：1.一个有意思的表型；2.找到与表型相关的microRNA并验证；3.找到这个microRNA的靶基因并验证。一般做完这几个部分这个故事就讲完了，要是再加点动物实验或是能与临床相结合，这篇文章分数一定不会低。今天我们要学习的这篇文章是上海交大附属第六人民医院骨科的杨庆诚课题组和范存义课题组联合发表的一篇microRNA研究文章。这篇文章的研究思路（套路）很有借鉴意义，特别是对来自医院的老师们。下面我们来具体看一看吧。

研究背景

骨肉瘤是一种恶性程度很高的原发性骨肿瘤，其发生率约为0.04～0.05/万，多数起源于骨间叶细胞，好发部位为长骨，一般为股骨远端或胫骨近端，其次为肱骨近端。好发于10～20岁的青少年，占骨恶性肿瘤的20％左右，肺转移是其主要死亡原因，随着新辅助化疗 、保肢手术等的开展，5年生存率提高到近60％～70％。但由于化疗耐药性等问题的存在，患者仍面临着复发及肺转移的困扰。基因治疗、免疫治疗和分子靶向治疗等生物治疗技术的发展也为骨肉瘤的治疗开辟了新的道路，为骨肉瘤患者带来希望。早在1993年就有科学家发现线虫细胞能产生非编码的miRNA，并具有调控蛋白翻译的功能，但直到21世纪初期，miRNA的重要性才引起广大生物医学工作者的注意。

研究发现，miRNA表达与动植物的组织器官发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动过程密切相关；miRNA表达失控将导致重大疾病。miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。研究表明miRNAs 可以抑制重要的肿瘤相关基因的表达，可能在癌症的诊断和治疗中起重要作用。

实验设计

组蛋白去乙酰化抑制剂曲古菌素A（TSA）具有抑癌作用

结果展示

筛选目标miRNA

先通过microRNA microarray筛选出了差异表达的候选miRNA，再经qRT-PCR初步验证了其中的7个上调8个下调miRNA。再合成其中8个miRNA转入骨肉癌细胞系中进行功能验证，发现miRNA-542-5p可作为目标miRNA进行后续研究。

目标miRNA的功能验证

细胞增殖实验和细胞周期分析，发现miRNA-542-5p在两种骨肉瘤细胞系MNNG/HOS cell line、U2OS cell line中确实影响细胞增殖和细胞周期。

克隆形成实验、裸鼠成瘤实验进一步的验证miRNA-542-5p具有促进肿瘤发生作用。

筛选目标miRNA的靶基因

用iTRAQ技术筛选差异蛋白。这一步作者还是用两种骨肉癌细胞系同时做筛选，这样选择在两种细胞中都表现为差异表达（1.5>或<0.67）的蛋白作为候选蛋白。这样做有助于缩小选择范围，因为在每一种细胞系中差异蛋白的差异表达倍数和蛋白数目不尽相同，取交集有助于缩小范围。本研究中有9个蛋白在两组中都表达上调，7个蛋白在两组中都表达下调。考虑到miRNA一般是结合到基因的调控区抑制基因表达的，所以研究者着重考虑差异表达下调基因，选取了HUWE1、CSE1L、PTBP1等3个蛋白作为后续验证对象。进过western blot和荧光素酶实验确认了HUWE1是直接与miRNA-542-5p作用的靶基因。

靶基因的功能研究

既然已经找到HUWE1，那么抑制miRNA-542-5p的表达，作为下游直接与之结合的靶基因，其表达应该是上调的。miRNA-542-5p作为一种促癌miRNA，在细胞增殖试验中，抑制miRNA-542-5p，HUWE1表达上调，细胞增殖减弱。这个时候再用siRNA抑制HUWE1的表达，细胞增殖又将增强。细胞周期实验也与预期结果想符。这些实验就确证了HUWE1是miRNA-542-5p把基因的事实。

临床样本验证

临床样本研究发现，癌症组织中miRNA-542-5p的表达要高于癌旁组织；miRNA-542-5p低表达的病人手术后生存率高于miRNA-542-5p高表达的病人；HUWE1在miRNA-542-5p低表达的病人和miRNA-542-5p高表达的病人中的表达情况与之前结果一致。但是HUWE1在癌症组织和癌旁组织中的表达情况与预期不符。

小编点评

看了以上文章解读，是不是对miRNA的研究思路（套路）了然于胸了呢，是不是很简单。其实从这个思路出发，我们可以做很多方面的研究。

我们可以大概总结一下，应该是这样的：表型（疾病）→找差异蛋白（基因）→验证。思路虽然简单，但实验做起来就没那么简单了。我们的蛋白质谱平台能帮您找到差异蛋白，但后续验证特别是western blot其实不好做，一旦抗体出现问题就不好解决了。但是，我们有用质谱验证蛋白表达的秘法，这里小编我先卖个关子，下期再给各位老师介绍。

参考文献

Cheng DD, Yu T, Hu T, et al. MiR-542-5p is a negative prognostic factor and promotes osteosarcoma tumorigenesis by targeting HUWE1. Oncotarget. 2015 15;6(40):42761-72. 

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