产抗菌肽乳酸菌的筛选和分离纯化

利用琼脂扩散法筛选产抗菌肽的菌株，运用细胞吸附解吸和阳离子交换层析法纯化抗菌肽，从热稳定性、酸碱稳定性和蛋白酶敏感性3方面研究抗菌肽的理化特性。实验中筛选得到7株产抗菌肽的菌株，其中菌株4121具有较广的抑菌谱，命名为鼠李糖乳杆菌4121。对抑菌物质进行分离纯化和理化性质测定，电泳结果显示抗菌肽的分子量约为11 kDa，最终获得的抗菌肽比活力为12379.11 AU/mg，最终纯化倍数为91.99倍。该抗菌肽的抑菌能力在20~80℃及偏酸条件下具有很好的稳定性。同时该抗菌肽对蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感。筛选出的鼠李糖乳杆菌4121所产生的抗菌肽热稳定性及酸稳定性良好，具有广谱抑菌能力，并建立了有效的抗菌肽分离纯化法—细胞吸附解吸-阳离子交换层析法。

1 产抗菌肽乳酸菌的筛选与鉴定

对91株实验室前期已分离出来的乳酸菌进行琼脂扩散法筛选，采用5株指示菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、单增李斯特氏菌)测定不同乳酸菌的抑菌谱和活性，结果见表1。91株乳酸菌的发酵上清液经过酸排除和过氧化氢排除实验后，具有抑菌效果的有7株，分别是3123、3222、3325、3521、4121、SA2和SC3。从表1可以看出，这7株菌株发酵上清液的抑菌效果不是由有机酸或过氧化氢引起，而是存在着其他抑菌活性物质。对这7株具有抑菌活性的菌株进行革兰氏染色，观察菌体形态(图1)。发现3123、3222、3325、3521 和4121菌株为革兰氏阳性杆菌，而SA2 和SC3是革兰氏阳性球菌。16S rDNA鉴定结果表明(表2)，株菌3123、3222、3325和35214分别为魏斯氏菌属；菌株SC3为微球菌属，菌株4121为鼠李糖乳杆菌属，菌株SA2为葡萄球菌属。因此最终选择这7株菌中抑菌谱和抑菌活性最好的一株菌(即鼠李糖乳杆菌4121)作为进一步的实验菌，用于后续抑菌物质的分离纯化和特性研究。

 2.抗菌肽的分离纯化

运用2步纯化方法对鼠李糖乳杆菌4121所产的抑菌物质进行分离纯化，首先利用抗菌肽吸附解吸的特性进行抗菌肽的粗提取。抑菌结果发现解吸液具有较强的抑菌活性，活力为2560 AU/mL，蛋白回收率为40.80%。说明细胞吸附解吸方法可以达到纯化鼠李糖乳杆菌4121所产的抑菌物质的效果。将解吸液经阳离子交换柱进行分离纯化，结果如图2所示。2个蛋白吸收峰，记为峰1和峰2，收集峰1和峰2洗脱液，然后进一步超滤浓缩。结果表明，仅峰1有抗菌活力，回收率为34.78%，经测定比活力为12379.11AU/mg，最终蛋白纯化倍数达到了91.99倍。通过非变性凝胶电泳分析，仅发现峰1收集液分子量为11 kDa(图3)，并且确定抗菌物质是一类多肽或蛋白类物质。

3  抗菌肽特性研究

3.1  酸碱稳定性

研究报道虽然不同乳酸菌抗菌肽的pH稳定性不同，但其在酸性条件下更有利于保持抗菌肽的特性均一致。本实验结果表明鼠李糖乳杆菌4121所产抗菌肽在pH=2.0~5.0之间，随着pH的增加，抗菌性随之增加，在pH=5.0时抑菌活性达到最大。在pH=5.0~9.0范围之间，抑菌活性随着pH值的升高而降低，当pH=9.0时，抑菌活性消失(图4)。说明在酸性条件下，抗菌肽的活性更稳定，且具有一定的酸碱稳定性。

3.2  热稳定性

分别测定了20~120℃范围之间鼠李糖乳杆菌4121所产抗菌肽抑菌活性(图5)。结果显示抗菌肽在20~80 ℃范围内均有较好抑菌效果。但是温度超过80℃时，抗菌肽抑菌活性呈现下降趋势，当温度达到120 ℃时，抑菌活性达到最低。综上所知鼠李糖乳杆菌4121所产抗菌肽在20~80℃范围内具有一定的热稳定性，可以在一些非热加工食品中运用。

3.3 蛋白酶敏感性

对鼠李糖乳杆菌4121所产抗菌肽的蛋白酶稳定性进行研究，结果显示鼠李糖乳杆菌4121，所产的抗菌肽对蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感，而对胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，抑菌活性与对照组相比未明显降低(图6)。这也进一步证明了鼠李糖乳杆菌4121 所产的抑菌物质是蛋白类物质。

4 结论与讨论

本研究对实验室现有的91株乳酸菌进行了产抗菌肽活性的筛选，共筛选出了7株具有抑菌活性的菌株，进行常规形态学观察并结合16S rDNA 基因鉴定，发现3123、3222、3325 和3521为魏斯氏菌属；4121为鼠李糖乳杆菌属；SA2为葡萄球菌属；SC3为微球菌属。从抑菌谱来看，鼠李糖乳杆菌4121产生的抑菌物质不仅对革兰氏阳性菌如单增李斯特氏菌具有较好的抑制效果，同时还对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌具有抑菌作用。这说明鼠李糖乳杆菌4121所产的抑菌物质可能是一种新型的，具有广谱抑菌效果的抗菌肽。对鼠李糖乳杆菌4121所产抗菌肽的特性研究后发现,该抗菌肽在20~80℃范围内以及pH=5左右时具有很好的抑菌稳定性，同时该抗菌肽对蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感，而对胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，这一现象与报道的其他抗菌肽性能类似。总之， 鼠李糖乳杆菌4121所产抑菌物质是一种具有广谱抑菌活性，性质稳定的多肽，具有潜在的较大的应用价值。

参考文献

[1]章简明,步雨珊等.产抗菌肽乳酸菌筛选及抗菌肽的分离纯化与特性研究[J].食品安全质量检测学报,2018,9(4):781-787.

[2] Gaaloul N, Braiek O, Hani K, et al. Isolation and characterization of large spectrum and multiple bacteriocin-producing Enterococcus faecium strain from raw bovine milk [J]. J Appl Microbiol, 2015, 118(2):343-355.（转自“沃看畜牧”）