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居漪 上海市临床检验中心副主任兼临床生化室主任
随着世界经济的发展、生活方式的改变、生存环境的变化、社会的老龄化、医疗保健服务的进步，使得慢性非传染性疾病（Noninfectious Chronic Disease，NCD）的发病率和患病率逐年上升，医疗费用的增加对个人、家庭和社会均带来沉重负担。糖尿病的慢性高血糖症会造成患者的长期损害、机能障碍、多种器官衰竭。因糖尿病而死亡已成为仅次于心血管疾病和癌症的第三大死亡原因。
目前，根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）的报告，2013年全世界糖尿病患者有38200万（占成人人口8.3%），其中未诊断患者有17500万（占46%），有510万患者死亡；糖尿病治疗费用达5480亿美金（占世界总医疗费用的11%）；预计到2035年全世界的糖尿病患者将达到59200万（占成人人口11%）。中国糖尿病协会（Chinese Diabetes Society，CDS）报告，2013年我国糖尿病患者数已达9840万（20-79岁），其中未诊断患者有5323.8万，有127.1万患者死亡；平均每人用于治疗糖尿病的医疗费用为333美金。我国的患者人群位列世界三甲之首，印度次之（6510万），美国第三（2440万），糖尿病已然成为了世界性的公共卫生问题。
一、糖化血红蛋白（HbA1c）与糖尿病
理想的诊断指标应兼顾实验室检测方法和生物体内的变化状态。对于糖尿病的诊断，实验室传统的手段采用空腹血糖（FPG）和口服糖耐量试验（Oral Glucose Tolerance Test，OGTT）。目前采用的是WHO 1999年推荐的糖尿病诊断标准，其采纳了美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）1997年建议的诊断切点FPG≥7.0mmol/L、2小时血糖（2hPG）≥11.1mmol/L，但这些方法诊断糖尿病受较多因素影响，其一，血糖反应的是急性糖代谢水平，个体内和个体间的生物学变异均较高（见表1），导出的检测允许总误差较大，大的偏移必然会给临床诊断带来大的不确定性；其二，由于葡萄糖酵解的影响，实验室检测前误差较大；其三，OGTT操作复杂，临床实施比较困难，患者依从性较差。
糖尿病对患者的损害以及慢性并发症的出现是一个长期的连续过程，因此仅用个体一个检测“点”的血糖水平进行诊断和管理糖尿病，不足以客观地反映患者状况，无法起到全面监控、减缓并发症的出现。
为此，业界专家积极找寻应对的方案，探索新的诊断方法和指标。两个堪称里程碑式的糖尿病流行病调查：英国前瞻性糖尿病研究（UK Prospective Diabetes Study，UKPDS）和美国糖尿病控制和并发症试验（Diabetes Control and Complications Trial Research，DCCT）分别从上世纪70年代和80年代起进行了近十年的研究，其中，均将最早由Rahbar发现于上世纪60年代的糖化血红蛋白作为糖尿病控制的一个重要指标。研究结论是一致的：通过治疗，控制平均血糖水平，控制HbA1c可以有效地治疗糖尿病，大大降低如视网膜疾病、肾病和神经病变等糖尿病并发症的发生率和严重性；任何糖尿病终点事件发生率都随着HbA1c增加而增加。HbA1c以其较传统血糖检测的优势（见表2）、糖尿病诊治中的重要作用在临床上得到了越来越广泛的应用。至2010年，ADA颁布的《2010年糖尿病诊疗指南》和同期发布的《糖尿病诊断和分类》中均正式确定将HbA1c作为糖尿病诊断的一种方法，诊断切点为≥6.5%。
二、HbA1c实验室检测
1.HbA1c概述
人全血中的血红蛋白由HbA（ααββ，95～97%）、HbA2（ααδδ，2.5～3%）、HbF（ααγγ，0.5～1%）组成。HbA中约90%为非糖化血红蛋白（HbA0），5～8%为糖化血红蛋白（HbA1）。HbA1由与果糖-1,6-二磷酸结合的HbA1a1（1.6%）、与葡萄糖-6-磷酸结合的HbA1a2（0.8%）、与其他碳水化合物结合的HbA1b和与葡萄糖结合的HbA1c（5%）4种成分组成。对HbA1c与糖尿病关联的研究已超过了30年。
目前，根据国际临床化学与医学实验室联盟（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）命名、特性和单位委员会（C－NPU）公布的定义HbA1c化学结构通常为具有一个特定六肽的血红蛋白分子，是葡萄糖和血红蛋白β链N－端缬氨酸（βN－1－去氧果糖基血红蛋白）的一个稳定加合物。在人体内，葡萄糖和血红蛋白β链N末端缬氨酸氨基之间进行非酶促反应，先形成不稳定的希夫碱（Schiff base），然后缓慢地重排，形成稳定、不可逆的氨基酮。因为HbA1c与红细胞的生存有关，其合成速率与平均120d生命周期的红细胞糖化量成正比函数关系，临床上它代表了最近2～3月平均血糖水平的控制。由于糖化血红蛋白（HbA1c）是非均一的物质，可与葡萄糖结合的位点有β-N-Val-1（IFCC定义的HbA1c化学结构）、α-Lys-16、β-Lys-66、β-Lys-17、α-N-Val-1、α-Lys-7和β-Lys-120，现有的各种检测方法根据可捕捉的物质不同，其被测量（measurand）也不同，因此，对HbA1c分析物的定义极其依赖于检测的方法原理。目前，临床实验室常规使用的HbA1c检测方法达30多种，方法分类见表3。
所有常规检测方法的被分析物HbA1c都是自我定义的，而实际HbA1c值是不同的。由于受各种干扰，如：红细胞生存期的改变、变异血红蛋白、黄疸和高脂血症、乙酰化血红蛋白、氨基甲酰化血红蛋白等因素均可造成HbA1c值出现假性升高或降低，所有检测方法都存在非特异性，且影响到采用HbA1c值评估患者平均血糖浓度的准确性。因此，HbA1c检测的标准化和质量管理显得尤为重要。
2.临床决策与检测性能
大部分临床专家建议患者连续2次HbA1c检测结果差异大于0.5%（或5mmol/mol），为临床上有显著性改变，需要进行治疗方案的调整。这主要考虑了ADA根据患者的视网膜病变患病率确定了HbA1c的诊断切点为6.5%，DCCT和UKPDS降低并发症风险的治疗目标为≤7%，2005年IDF发布的糖尿病指南[14]中推荐当HbA1c>7.5%时考虑使用胰岛素治疗等临床数据后，对实验室的检测性能提出的要求。这个“临床上有显著性改变的值”被称为参考变化值（Reference
Change Value，RCV），可以通过公式进行分析：Z×[2(CVA2＋CVw2)]½，其中CVA方法不精密度，CVw个体内生物变异，Z=1.96(P＜0.05)。
采用最新的研究CVw为0.8%（DCCT），通过计算得到：小于2.4%的CVA就是区分HbA1c 7.0%和6.5%所必要的分析性能。换言之，实验室使用了精密度小于2.4%的检测方法（或产品），2次检测结果的差异反映了患者健康状况真正发生了改变，而不是因为选用的检测方法不精密造成的误差。
为了满足临床决策需求，国际上对HbA1c的检测性能提出了控制标准，室内不精密度小于2%，室间不精密度小于3.5%。美国临床病理协会（College of American Pathologists，CAP）组织的室间质评，对评价实验室合格标准采取了“逐年精进”方针，将允许总误差由2005年的靶值±15%、2008年提高为±12%、2009年为±10%、2010年为±8%、2011年为±7%[18]，2013年和2014年达到了±6%。
三、HbA1c国际标准化
HbA1c的检测方法涉及层析技术、电泳技术、免疫技术、生化（酶学）技术、快速检测技术，不同检测方法的结果存在显著差异，建立参考（参比）系统从源头上进行管控势在必行，国际上2大HbA1c标准化组织应运而生。1993年美国临床化学协会（American Association for Clinical Chemistry，AACC）率先成立分委会进行HbA1c标准化工作，目标是校准实验室检测方法、指导室间质评活动。1996年建立的美国国家糖化血红蛋白标准化计划（National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP）由执行委员会和参考实验室网络组成。由1个管理核心通过核心实验室（CPRL）、一级实验室（PRL）、二级实验室（SRL）组成的参比实验室网络用新鲜血样品比对来评估临床实验室和厂商的检测方法间的偏差、降低室间差异，使得检测结果与DCCT实验结果联系起来。至2015年1月全球有150家临床实验室通过了NGSP的水平1和水平2实验室认证。
NGSP采用的阳离子交换色谱法有着其众所周知的局限性（如，受HbF、变异血红蛋白等因素干扰），由于该方法有着长期稳定的优点，仍将其作为参比方法，但是，该方法无法实现欧洲议会和理事会1998年对体外诊断医疗器械（In vitro Diagnostic Medical Devices，IVD MD）指令中提出的临床实验室检测结果计量学溯源的要求。1995年IFCC随之开启的国际糖化血红蛋白标准化计划目标就是为HbA1c这个糖尿病诊治的“金指标”建立一套符合计量溯源规范的参考系统。IFCC HbA1c工作组研究了参考方法、研制了参考物质、建立了参考实验室网络。在建立的实验室网络中，用推荐的高效液相/电雾化质谱（HPLC-MS）或高效液相/毛细管电泳（HPLC-CE）参考方法检测、用研发的纯度达98%的HbA1c和HbA0进行校准，其结果可以溯源至SI至单位（mmol/mol），室内CV为0.47～2.07%；室间CV为1.35～2.27%。IFCC HbA1c工作组另一项重要任务，就是将IFCC参考方法与NGSP、日本糖尿病协会/日本临床化学协会（JDS/JSCC）和瑞典制定的国家参考系统进行HbA1c方法学比对研究，建立了相关线性回归模型，该结果在经过了六年的跟踪研究后被证明是稳定和可靠的。通过金方程：NGSP=0.0915IFCC+2.15，实现检测结果IFCC的mmol/mol单位与NGSP的%单位的互相转换。
目前，NGSP参考实验室的1家CPRL、1家PRL、4家SRL同时也是IFCC网络实验室；IFCC提供参考品定期校准NGSP方法，NGSP的靶值可以直接溯源至IFCC一级参考方法的赋值。IFCC与NGSP两大工作组正协同工作推进标准化，制定质量标准、推行临床实验室和厂商认证、指导组织室间质评，欲使各种方法结果具有可比性、实现溯源性。IFCC和NGSP认证方法比较见表4。
国际标准化工作对规范、提高HbA1c检测质量是卓有成效的。CAP2014年第2次质评结果显示，用靶值±6%允许总误差标准评价全球3000多家参加调查实验室，3个样品符合率>93.5%；有90%的实验室使用的方法组CV≤3.5%；每个样品总体C≤3.6%，先前报道了2000年到2010年总体CV从7%降至4%，2010年至今依然稳定在<4%（除外2012年HbAS样品）。
基于标准化工作的成效，IFCC与美国糖尿病学会（ADA）、欧洲糖尿病研究学会（EASD）、国际糖尿病联盟（IDF）以及国际儿科与青少年糖尿病协会（ISPAD）在2007年和2010年分别达成了国际共识声明，内容主要包括：①HbA1c结果实现全球标准化，包括参考系统和结果报告。②IFCC参考系统是进行HbA1c测量标准化的唯一有效系统。③HbA1c以IFCC（mmol/mol）和推断的NGSP（%）单位报告，使用IFCC-NGSP转换方程。在此基础上，IFCC启动了HbA1c整合计划，其目的是在IFCC及其成员和HbA1c的临床使用者之间建立关联，在HbA1c已标准化至IFCC参考方法前提下，使得临床上科学合理地运用HbA1c报告方式。目前，澳洲、大部分欧洲国家已开始使用mmol/mol单位报告结果。
在2010年ADA将HbA1c列入诊断指南后，2011年1月WHO发表了《应用糖化血红蛋白诊断糖尿病》的咨询报告指出，当HbA1c的测定有严格的质量控制保证并能溯源至一个国际标准化参考体系，并且不存在干扰其测定结果准确性的情况时，HbA1c可以作为糖尿病的诊断实验，并推荐HbA1c 6.5%为诊断切点。
为配合标准化工作，2011年，美国临床生化科学院（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）发布的《糖尿病诊疗实验室检测指南和建议》中强调了IVD厂商应使用IFCC参考方法校准检测方法、提供可溯源至IFCC参考方法的证明。
四、HbA1c国内标准化现况和展望
在我国，对HbA1c的临床意义的认识、检测规范制定均落后于其他发达国家，，至2011年下降为6%-9%，但是比CAP同年调查结果大1倍以上。2010年，中华医学会检验分会发布了《糖尿病诊断治疗中实验室检测项目的应用建议》来规范糖尿病的临床诊治和实验室诊断。
同年3月由中华医学会科普部牵头，中国医院协会临床检验管理专业委员会协作下启动了《中国糖化血红蛋白教育计划》项目，其目的就是要强化和提高临床医护人员对HbA1c在糖尿病管理、诊断、筛查中的重要性的认识，推动HbA1c检测标准化工作。从而最终使HbA1c检测这个“金指标”能够真正有效的应用到临床中。目前，第二个3年计划正在进行中，希望以循证医学为依据，促进HbA1c在我国糖尿病管理中的广泛和正确使用，加速HbA1c检测方法的标准化进程。
教育计划开展至今已有5年，但鉴于HbA1c检测在我国尚不普遍，检测方法的标准化程度不够，测定HbA1c的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求。中华医学会糖尿病学分会（CDS）颁布的2013年版《中国2型糖尿病防治指南》中仍不推荐在我国采用HbA1c诊断糖尿病。但对于采用标准化检测方法，并有严格质量控制，正常参考值在4.0%-6.0%的医院，HbA1c≥6.5%可作为诊断糖尿病的参考。在2012年发布的卫生行业标准《糖尿病筛查和诊断》中也暂不推荐将HbA1c检测作为糖尿病的诊断方法。
虽然HbA1c目前尚未作为诊断指标列入我国的糖尿病指南，但是，近5年来我国HbA1c标准化工作推进速度正在不断加快，成绩也是有目共睹的。在参考系统建设方面，我国目前已有3家实验室被IFCC正式接受成为HbA1c一级参考实验室，2011年上海市临床检验中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）第一个通过了认可， Center for Clinical Laboratory，NCCL）和北京市临床检验中心（Beijing Center for Clinical Laboratory，BCCL）分别于2013年和2014年加入。NCCL研制出了HbA1c国家一级标准物质。作为能力验证组织者NCCL和SCCL分别于2012年和2013年通过了中国合格评定国家认可委（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）ISO17043认可，采用国际标准进一步规范质评工作，推出了“HbA1c正确度验证计划”，发放用IFCC参考方法赋值的全血调查品，评价实验室检测结果正确性，提高检测质量。
在管理上，国家食品药品监督管理局（CFDA）组织的医药行业标准《糖化血红蛋白分析仪》、NCCL组织的卫生行业标准《糖化血红蛋白实验室检测指南》正在讨论修改中，标准明确了IVD产品质量和实验室检测规范，颁布后将产生更积极的推动效应。
在上海，2007年的一次抽样调查结果显示，HbA1c值约为6%的样品，实验室间变异系数CV高达8.1%-19.8%，SCCL随之通过制定标准、发放合适的质控品做室内质控、开展室间质评、强化人员培训等手段，对整个地区的实验室HbA1c检测质量进行全面质量管理。从2012年起，质评样品采用参考方法赋值的全血样品，评价结果的正确性。经过3年正确度计划的开展，参评实验室的总体合格率从70%提高到90%，其中二级甲等以上医院达到98.7%；每个样品总体CV稳定在<4.5%，整体指标与CAP质评结果一致，但个别方法性能不达标，如低压液相方法、POC方法。
展望未来，日益增加的国产试剂管理问题，基层医院检测规范问题，以及业界争论较多的是参照NGSP做实用的“一致性”还是跟着IFCC做严谨的“正确性”问题等，这些都需要我们去探索，相信只要团结协作，必将开创出我国自己的糖化血红蛋白标准化之路，为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、疗效观察提供准确、有效的检测结果，更好地服务于临床医生和糖尿病患者。
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