蛋白甲基转移酶(Protein Methyltransferases, PMT)是表观遗传学领域研究的重要分支，参与了对细胞命运的表观遗传性控制，并涉及肿瘤发生、发展、侵袭等过程的众多信号通路。PTM依赖于辅因子SAM (S-adenosyl-L-methionine)，将甲基基团转移至胞内或核内蛋白的Lys或Arg残基侧链上。目前已在超过2400余种蛋白中发现了甲基化现象的存在，其中又以组蛋白的甲基化研究最为详尽，后者在染色质介导的信号通路及细胞命运决定中扮演着核心角色。研究表明，甲基化失衡与癌症、神经退行性疾病等存在着高度相关性，与之相关的通路成员已成为药物研发领域的重要潜在靶点。
图1: Chemical Coverage of PMTs
迄今为止，人体中发现了50种含SET结构域的Lys甲基转移酶，以及13种带有Rossman fold的Lys或Arg甲基化酶(图1)。自2007年科学家们发现第一例PMT抑制剂以来，针对该家族酶活性抑制剂的研究取得了长足的进步，已发现7种Lys甲基化酶(PKMT)及3种Arg甲基化酶(PRMT)。通常甲基化酶包含多个结构域，因此也会同时具有多样化的功能。以人体中的MLL蛋白为例，除了含有甲基化H3K4必不可少的SET结构域外，还编码结合乙酰化Lys基团的BRD结构域、结合甲基化侧链的PHD结构域及结合为甲基化CpG岛的CXXC结构域(图2)，对不同结构域的靶向用药会产生完全不同的生理效应。除此之外，PMT还经常出现在一些大型的多蛋白功能复合体中，进一步增加了对其进行功能研究的复杂性，但同时也为药物研发提供了不同的靶向策略。
图2: Multimodular Nature of PMTs
作为甲基供体的辅因子SAM及接受甲基的底物分别结合在PMT上的不同位点(图3A)，两者间由一条狭窄的通道连接，也是甲基转移反应发生的位置(图3B)。针对以上两位点的PKMT抑制剂均有相关报道。通常底物结合位点相对较深且构成一个封闭的空间，从结构上推断有利于开展小分子抑制剂类药物设计；而事实上，绝大多数PMT抑制剂也正是底物类型的抑制分子。不同的酶会识别不同的底物，决定了PMT中底物结合位点结构的多样性。另外，针对同一种底物不同酶的抑制剂同样也可以具有选择性，如UNC0638可以抑制针对H3K9的甲基转移酶G9a和GLP，但却不能抑制SUV39H1及SUM39H2。
图3：Structural Mechanism of Cofactorand Substrate Competitors
SAM是所有PMT共同的辅因子，但与之相结合的氨基酸残基保守性却非常低，该区域结构上的多样性堪比蛋白激酶中的ATP结合位点。对于药物研发而言，该位点更大的挑战性在于其亲水性。SAM分子本身极性非常强，因此所开发的小分子抑制剂必须具有足够的极性以便占据SAM结合位点；同时又需要足够的疏水性来穿越细胞膜系统，很难实现。然而让人意外的是，迄今为止进入临床试验阶段的PMT抑制剂却都是辅因子竞争类型，分别是靶向H3K79的甲基转移酶DOT1L及H3K27的甲基转移酶EZH2，两者的功能异常分别于与白血病及淋巴癌相关。结构生物学研究表明，两类抑制剂采用了不同策略克服上述困难。针对EZH2的抑制剂一侧结合在EZH2与EED之间的疏水相互作用面上，而另一侧有很小一部分与SAM结合口袋相重合，但却足以实现对后者的抑制(图3D)；而针对DOT1L的抑制剂则通过改变SAM结合位点附近的微环境实现与其紧密结合(图3E)。
尽管辅因子竞争类型的抑制剂第一个进入了临床试验阶段，但它们采用“曲线救国”的策略以克服辅因子结合位点的亲水性。相比而言，底物结合的口袋区域更有利于药物设计开发，其作用模式也更直接。
Barsyte及Chan在研究SETD7及PRMT5潜在的底物竞争性抑制剂时发现，后者在缺乏辅因子时并不能结合到相应靶蛋白上(图5A)。一个简单的解释，可认为辅因子的存在对底物结合区域的形成及稳定存在是必不可少的；深入的结构分析会发现，抑制剂还参与了同辅因子SAM的直接相互作用(图5B)。Chan等发现破坏抑制剂与辅因子间的相互作用，会极大降低抑制剂与PMT之间结合的紧密程度(图5C)。结合对其他类型的PMT及晶体结构的分析，辅因子SAM中甲基基团的重要性逐渐凸显，可作为氢键的供体增加相互作用力度，为相应的药物设计及合理优化提供了一个新的视角。
图4: Structural Chemistryof Substrate Competitors
抑制剂分子骨架片段通常被认为太小而不能诱导产生或稳定蛋白中的构象变化，从而不能实现预想的药效。考虑到绝大多数PMT活性位点附近的结构动态性，片段筛选对PMT抑制剂类药物筛选似乎是个死胡同。在一项概念验证试验中，当片段脱离母体化合物后，并不能抑制相应的PKMT活性(图4D)，尽管在G9a的个例中，容纳甲基化Lys的口袋区域在配体缺失的情况下就已经形成。凡事总有例外，Ferreira在研究一个IC50值为300nM的抑制剂片段时发现，该片段可以占据甲基化Arg的结合区域，尽管这一区域在缺乏配体时并没有完全形成。结构分析发现该片段末端的氨基可与催化活性中心的谷氨酸形成稳定的静电相互作用；该氨基酸残基在PRMT中具有保守性，提示其可作为相互作用的热点来对带有正电荷的抑制剂片段库进行活性筛选。
PMT家族底物结合位点独特的结构可变性对抑制剂的从头设计策略是个极大的挑战，迄今为止成功案例极少。但多亚基的存在，也为别构抑制剂的设计提供了机会。在对DOT1L抑制剂的研究中，曾发现抑制剂会占据辅因子结合位点旁的空间，影响甲基转移反应活性中心区“loop”的构象，使其处于活性未完全激活状态(图3)。
别构抑制剂的一个案例来自PRMT3。像绝大多数PRMT家族成员一样，PRMT3由一个Rossman fold，一个β桶状区及一段负责形成同源二聚体的α螺旋构成(图6A)。在复合体结构中，抑制剂SGC707结合在β桶状区与二聚化α螺旋臂形成的沟槽内，与催化活性位点相距10Å。蛋白N端一段有助于底物结合的α螺旋在抑制剂存在时会变得无序，一个可能的解释是抑制剂的存在改变了催化活性中心周围的微环境而阻止了活性构象的形成，该推测已经在生化层面得到证实。另一个案例来自PRMT6。在复合体结构中，抑制剂结合位点同辅因子及底物结合位点的距离超过10Å，通过一种未知方式改变N端α螺旋稳定性而导致部分底物结合位点的缺失，最终阻止酶分子活性状态的形成(图6B)。
图5：Allosteric Inhibition of PMTs
更多作用于PRMT及PKMT SET结构域的别构抑制剂将会在未来的研究中出现。值得关注的是，结合于别构位点的化合物同样可以扮演激活剂的角色，这对于SETD2、MLL等肿瘤抑制蛋白而言，将是另一个大有作为的舞台。
PMT通常由多个结构模块组成，以实现复杂化的功能。针对非催化结构域设计的小分子抑制剂可在不改变PMT甲基转移酶活性的同时，抑制其上下游生理功能。目前研究较多的PMT及相应的靶点非催化结构域如下表：
PMT除了具有多功能结构域的特点外，还通常作为大型染色质复合体的组分来协同发挥作用。以MLL为例，其N端及C端分别存在一段序列负责识别结合Menin及WDR5蛋白。后两者是复合体行使功能必不可少的骨架分子。前期针对MLL的靶向药物研发并不成功，但化合物MI-403 却展现出了良好的抗白血病活性，其作用靶点为Menin上的MLL结合结构与，从而有效破坏了两者之间的相互作用(图7A)。同样策略也发现于化合物OICR-9429中，该化合物会占据WDR5上的MLL结合区域而破坏两者复合体的产生。
图6：Disrupting Chromatin Complexes
靶向染色质复合体的抑制剂开发将是一种很有前景的药物研发策略，可用于针对不适于设计抑制剂的酶分子；或拮抗PMT的非催化活性；另外还可作用于由于突变而对催化活性抑制剂不敏感的肿瘤细胞。
蛋白甲基转移酶，特别是组蛋白甲基转移酶与异染色质的形成、基因的转录调控以及肿瘤形成密切相关。组蛋白甲基研究已成为表观遗传学的重要研究内容，是分子生物学、肿瘤学关注的热点，也是抗肿瘤药物研发的重要靶点。本综述涵盖了自2007年第一种PMT抑制剂，BIX-01294，发现以来所有针对该酶家族抑制剂的设计和研究策略, 以期抛砖引玉。随着研究的深入，越来越多的PMT抑制剂将进入候选药物的临床筛选阶段。
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原文链接：Matthieu Schapira. (2016) ChemicalInhibition of Protein Methyltransferases, Cell Chemical Biology,23(9):1067-1076. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.chembiol.2016.07.014
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