his融合包涵体蛋白的柱上纯化及复性策略

2023-05-10 14:56:27

his融合包涵体蛋白

外源基因在大肠杆菌中表达后常形成不溶性的无活性包涵体。包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍。然而，在合适的条件下，包涵体经过溶解、纯化、复性过程后可在体外重新折叠成有活性的蛋白质。

his融合蛋白的表达

接种隔夜培养的E. coli到5 mL LB培养基（含50 μg·mL^-1卡那霉素），将过夜培养的重组E. coli按1%的接种量接入200 mL LB培养基（含50 μg·mL-1卡那霉素），在37 ℃和220 r/min下培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）最终浓度为0.1 mmol·L^-1，在37 ℃继续培养6 h，并对诱导剂浓度、培养温度和培养时间进行优化。培养结束后，离心（8000rpm,10min)收集菌体，收集的菌体用生理盐水（0.85%的氯化钠溶液）洗涤2次，然后取适量菌体，用1:10（菌体：缓冲液）的缓冲液重悬菌体，并超声破碎，破碎后的上清和沉淀分辨SDS-PAGE检测his融合蛋白的表达量及表达形式。

菌体破碎

将培养液4 ℃离心10 min（7000rpm）收集菌体，用PBS缓冲溶液（pH7.5）洗涤菌体。以十倍体积浓缩加入PBS，进行超声波破碎。功率40 W，超声4 s，间歇6 s，超声时间15 min。破碎后的菌液于4 ℃离心10 min（10000 rpm），使包涵体沉淀与可溶性蛋白分离，分别收集沉淀与上清液。

his融合包涵体洗涤

包涵体粗品加入到10ml冷的洗涤液（20 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton X-100）中，搅拌20min。4℃，12000rpm离心25min，弃上清，取沉淀。重复一次（洗涤2～4h去除膜碎片和膜蛋白）。所得沉淀再用50mmol/L Tris-HCl洗1次（以去除残留的EDTA），相同离心条件，离心弃去上清，所得的沉淀即为洗涤后的包涵体。

✿包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体黏连在一起，可以通过洗涤除去大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5,1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤除去膜碎片和膜蛋白。同时因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可以加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达50%以上。

his融合包涵体蛋白的溶解

将上述沉淀加入10ml包涵体变性溶解液重悬（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，6 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或1 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton），于室温搅拌30-60min以充分溶解，4℃ 12000rpm离心15min，弃沉淀取上清。将上清用0.22um或0.45um滤膜过滤。

✿变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀，溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化，较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%。盐酸胍是较强尿素变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体，溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白的共价修饰，成本高，在酸性条件下易产生沉淀，复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀，对蛋白质离子交换色谱有干扰。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出包涵体，通常含有一些链间二硫键和链内非活性二硫键，这就需要加入还原剂，如巯基乙醇，二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤癣糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。

his融合包涵体蛋白的柱上复性及纯化

取5-10ml变性上样缓冲液（20 mmol·L^-1 Tris-HCl，500 mmol·L^-1NaCl，6 mol·L^-1尿素，5mM·L^-1咪唑，1mM·L^-1巯基乙醇，pH=8.0）平衡 Ni-I6FF（IMAC-武汉汇研生物,联系微信514099167）柱，流速为0.5 mL·min^-1。将经0.45 μm滤膜过滤后包涵体溶解液上样，流速为0.5 mL·min^-1。取10ml洗涤缓冲液（20mM·L^-1 Tris-HCl，500 mmol·L^-1NaCl，6 mol·L^-1尿素，5mM·L^-1咪唑，1mM·L^-1巯基乙醇，pH=8.0）洗柱，直至OD280不再变化，流速为0.5 mL·min^-1。依次以含有5、4、3、2、1、0 mol·L^-1尿素的复性缓冲液（20 mmol·L^-1 Tris-HCl，500 mmol·L^-1NaCl，0.1 mmol·L^-1氧化型谷胱甘肽，1 mmol·L^-1还原型谷胱甘肽，pH8.0）洗柱，每个梯度10 mL，流速为0.2 mL·min^-1。再以含有400 mmol·L^-1咪唑的复性缓冲液洗脱，流速为0.5 mL·min^-1，复性过程中OD值随时间的变化，并收集各阶段洗脱液，4 ℃离心10 min（10 000 r/min），取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。将不含尿素的洗脱液用荧光法测酶活。