对于研究特定胞内结构、细胞器或蛋白，抑或是分析这些大分子结构间的相互关联而言，将不同胞内区室相互分开是一个十分重要的步骤。亚细胞分离就是利用诸如浮力密度、表面电荷密度、尺寸及大小等一个或多个不同的属性，主要在高粘度介质中于4oC进行差速离心来实现的。用于差速离心的介质主要是蔗糖、甘露糖醇、甘油、菲可400（一种蔗糖多聚物），Percoll（胶体硅）和碘克沙醇（OptiPrep）。蔗糖由于其廉价所以被广泛使用，但是这些介质都有其各自的优势与局限性。小鹿在这里主要会讨论几种分离方法，并且重点关注那些大多数实验室都能便于操作且不太费时的方法，因为能够进行快速回收是至关重要的。同样也可以使用凝胶过滤、亲和层析、电泳或选择性密度位移扰动。现有操作流程中条件的变化取决于细胞器、组织或细胞类型以及所使用的设备。最后，分离的纯度与产量应当在整个操作过程中通过每种收集的组分中不同标记物的检测来进行评估。下面是最常用的细胞器分离方法。使用大鼠肝脏进行分离的方法目前已经详细讨论过了，并且很容易在文献中找到，因此小鹿这一部分的重点是讨论其它的模式体系。
胞质-核质-染色质的分离
胞质、核质与染色质组分可以很容易地从培养的细胞团中得到 。细胞被重悬于含有0.34 M蔗糖、10%甘油、低浓度温和去垢剂（0.1% Triton X-100）及K+和Mg2+（防止核破裂）的缓冲液中。通过低速离心就可以使核成团而上清就被保留下来作为胞质组分。之后，细胞核裂解于含有螯合剂EDTA与EGTA的缓冲液中，不可溶的染色质就可以通过低速离心来使之成团，而上清即为核质组分 （图3）。
有些研究者会进行“快速而粗糙”的染色质制备，其上会结合有胞质/核质蛋白。这可以通过在含有1% Triton X-100的裂解缓冲液中裂解细胞来进行操作。在该缓冲液中，染色质与一些细胞骨架结构是不溶的，可以通过离心来进行回收。沉淀块可以重悬于所选的缓冲液，例如用于SDS PAGE的Laemmli 。
图3. 示意图显示Mendez和Stillman [1] 从培养细胞中进行亚细胞分离。
通过差速离心从培养的细胞中酵母中分离线粒体
将长成单层或悬浮状态的细胞团在含有MgCl2和KCl的匀浆缓冲液进行均质化。然后将蔗糖加至0.25 M，通过低速离心（1000 g）就可以使核成团。以5000 g对上清进行二次离心就会使线粒体沉淀。沉淀块重悬于含有蔗糖和Mg2+的溶液中并在杜恩斯匀浆器中轻柔地抽几下。最后于5000 g的离心步骤会使线粒体富集，然后可以重悬于含有0.25 M蔗糖的Tris缓冲液或利于后续分析的缓冲液（例如Laemmli） 。
酵母细胞要用酵母裂解酶处理使坚硬的外侧细胞壁破碎，然后产生原生质球形体，再用山梨醇缓冲液清洗。沉淀块重悬于含有0.6 M甘露醇的匀浆缓冲液中并在杜恩斯匀浆器中抽几下使细胞裂解。细胞核通过低速离心去除而含有胞质的上清用定角转子于6500 g离心使线粒体成团。此外还有些利用密度梯度分离的操作流程可以制备更纯的线粒体组分，但是由于这些操作流程更加费时而被避用。尽管用差速离心得到的组分中会有溶酶体和过氧化物酶体的“污染”，它们仍是可供选择的方法。因此所想要的纯度决定了最适用的方法。例如想要进行代谢研究时会优选差速离心，或者在研究一种蛋白的精确位置时或必须需要最纯的样品时，比如蛋白组学中，利用密度梯度进行制备通常更为合适。
过氧化物酶体分离
通过2,000 g的离心得到的去核上清再于20,000 g离心30分钟。将含有过氧化物酶体和线粒体的沉淀块重悬于MS缓冲液中，然后置于溶在MS缓冲液的Nycodenz梯度（17%,25%, 35%, 50%）顶端。于116,000 g离心2小时后过氧化物酶体将位于组分2-8。要进一步分离过氧化物酶体膜相关蛋白可以通过Fujiki等人（1982）和Nuttley等人（1990）的方法来实现 [4] 。将上述提到的20,000 g离心得到的沉淀块重悬于10倍体积的Ti8缓冲液（Tris 10mM，pH8.0和PINS）中后于200,000 g分离1小时。含有过氧化物酶体膜的沉淀块再次重悬于Ti8缓冲液中。加入0.1 M碳酸钠后继续于200,000 g离心1小时后，过氧化物酶体膜就与结合在上面但并非整合在膜上的蛋白分开了。
溶酶体分离（从培养的细胞系中）
溶酶体、线粒体和过氧化物酶体在蔗糖梯度中的密度十分相似，因此要选择避免使用该方法。在Percoll中溶酶体更为致密，几乎或完全没有其它细胞器的污染。
清洗过的细胞在含有0.25 M蔗糖的3 mL缓冲液中用匀浆器抽5次，进行均质化。800 g离心10分钟后会使完整的核及碎片成团，将上清存放于冰上。细胞核沉淀块重悬于0.5 mL同样的缓冲液并像之前一样再次离心，将所得上清与第一次离心的上清混在一起。在该溶液中，将Percoll储存液（0.25%蔗糖）和牛血清白蛋白（BSA）分别加至终浓度为20%（注意：可以增加至27%-35%）与0.4%（终体积为4.5mL），并于36,000 g离心30分钟（注意：15,000 g离心60分钟至62,500g离心40分钟间变化均可）。使用梯度卸载器将梯度收集成0.4mL的组分，溶酶体通常靠近梯度的底部。为了更好地溶解溶酶体并增加回收率，在100,000 g离心1-2小时前加入NP-40至终浓度为0.5%。但是如果想要完整的细胞器的话，例如要进行代谢测试时，NP-40应当避免 。
黑素体分离
Kushimoto等人与Basrur等人使用的是溶于HEPES缓冲液的不连续蔗糖梯度 。更具体地来讲，细胞裂解物重悬于2 M蔗糖并放于一个不连续蔗糖梯度（1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0 M）的顶部。100,000 g离心1小时候，早期阶段的黑素体（I期和II期）从1.0-1.2 M的蔗糖区域中回收出来。经富集的组分通过Octopus-PZE FFE设备以2.0 ml/hr进行自由流电泳（FFE），从而进一步分成富含酪氨酸酶和富含蛋白的组分。使用溶于三乙醇胺、pH 7.4的0.25 M蔗糖，以1000–1100V及≈110–125 mA进行FFE，洗脱流速为3–4 ml/min [24] 。该操作过程可以产生高度富集的黑素体样品以用于蛋白质组学分析，通过该分析可以确定>60种黑素体蛋白 。
另一种制备高纯度黑素体组分的操作流程也是由同样的研究者发明的。溶于2 M蔗糖的细胞裂解物加至不连续蔗糖梯度的底部。100,000 g离心1小时后，将从蔗糖浓度约为1 M的区域中回收到的早期阶段黑素体再加至0.8、1.0和1.2 。这一附加的步骤会彻底去除线粒体“污染”。
晚期阶段的黑素体（III期和IV期）也可以从1.8 M的蔗糖层中回收出来，它们因含有较多的黑色素而较重。
外来体纯化
Welton等人已经从膀胱癌细胞系HT1376中提取到了外来体 。通过轻微的离心去除细胞（400 g离心10分钟）与细胞碎片（2000g离心15分钟后10,000 g再离心30分钟）后将上清置于氧化氘（D2O或重水）中30%蔗糖垫的顶部进行高速离心（100,000 g离心2小时）。用PBS清洗后外来体就在沉淀块中。Hogan用以下的方法从尿液中分离到了外来体。在150,000 g中离心1小时之前，尿液样品先于15,000 g离心进行预清除并且经过8 μm尼龙过滤器处理。沉淀块中含有外来体样的囊泡以及Tamm-Horsfall蛋白（THP或尿调节素）这种尿液中的主要蛋白。为了去除THP，将样品置于溶于重水、pH 6.0的不连续蔗糖梯度（5-30%）顶部。于200,000 g离心24小时后将缓冲区域收集到14个相同的组分中。每个组分用PBS稀释5倍至10倍后于150,000 g再离心1小时，将含有纯净外来体的沉淀块进行回收。
组蛋白提取
组蛋白是胞内环境中最基本的蛋白质。这里所说的是从细胞或非洲爪蟾提取物中富集组蛋白的要点。将完整的、已经纯化的细胞核（就像之前的讨论那样）重悬于0.2 M硫酸（H2SO4）并4oC离心后大部分的细胞蛋白都沉淀了，而组蛋白仍然是溶于溶液中的，可以用16,000 g离心15分钟进行回收。或者也可以用2.5 M NaCl孵育的办法提取染色质化的组蛋白。
纯化高尔基体膜（从小鼠肝脏中）
Chen等人使用的高尔基体膜分离方法。将用含有0.5 M蔗糖的缓冲液制备的肝脏组织匀浆置于0.86 M蔗糖的顶部，然后再将0.25 M蔗糖覆盖其上。于103,800 g离心60分钟后，从0.5-1.3 M的界面间收集膜并调节至0.5 M蔗糖。
中心体分离
中心体可以从粘附的上皮培养细胞中分离到，但是产量并不多（Andersen使用了20多亿的细胞（2x 109））。细胞核通过低渗裂解去除而中心体则通过两个离心步骤来获取。首先置于50%蔗糖垫离心，然后用40%、50%和70%的蔗糖梯度进行离心。
Moritz等人按照如下操作从果蝇胚胎中分离到了中心体：生长至3.5小时的胚胎匀浆（溶于BRB80缓冲液+100 mMKCl及14%的蔗糖）于1,500g离心10分钟将脂类去除。上清中加入0.1-0.5%Triton X-100及50%蔗糖（终浓度）后被加至蔗糖梯度（4 mL 55%的与3 mL 70%的）上，以用于分离中心体。大多数中心体聚集于70%蔗糖垫的顶部。
伪足分离
移动中的细胞会在一侧形成一种延伸物，从而粘附于新位点并随后将其余的细胞体拉至新位点。这种延伸物就被称为伪足。Klemke及其同事已经开发了一种在趋化剂响应过程中从细胞体中分离伪足的方法。这是利用6孔或24孔平板中的Transwell迁移室来实现的。简要地来说，细胞粘附于孔径为3微米的滤膜上侧。完整细胞是无法通过这么小的孔的。但是当细胞感知到置于下方区域的趋化剂时，形成的伪足就可以经过并附着于滤膜的下侧。之后将细胞固定，伪足或细胞体可以用选择的缓冲液裂解并收集 。
细胞质、核、粗面与滑面内质网、质膜以及线粒体的分离
Song等人已经从小鼠肝脏中进行了亚细胞分离，该方法经过一些修改后也可以用于其它组织 。图4中的图表总结了整个操作流程。简要来说，肝脏匀浆于1,000 g离心10分钟后分成沉淀快（P1）与可溶部分（S1）。
图4. 示意图显示Song等人从小鼠肝脏组织中进行亚细胞分离。
悬浮于蔗糖终浓度为1.8 M的缓冲液（缓冲液的完整配方需要读者参考原始出版物）中的P1于70,900 g离心90分钟后会形成可供储存的含有肝脏细胞核的沉淀块（P2）以及0.25-1.8 M界面间的可溶性组分（S2）。S2重悬于0.25 M蔗糖后于1,200 g离心10分钟，含有粗制质膜的沉淀块进一步悬浮于蔗糖终浓度为1.45 M的缓冲液中并于68,400 g离心60分钟。0.25-1.45 M蔗糖中的可溶性组分加入含有0.25 M蔗糖的缓冲液后再于17,600 g离心10分钟。沉淀块重悬于蔗糖终浓度为1.35 M的缓冲液中并于230,000 g离心60分钟。将0.25-1.35M间的组分回收后用0.25 M蔗糖稀释并于40,000 g再次离心。之后的沉淀块含有纯化的质膜蛋白，可以储存起来。
可溶性组分S1于8,000 g再次离心。这会形成含有粗制线粒体的不可溶组分（P5）和含有内质网（轻微体和重微体）及高尔基复合物的可溶性组分（S5）。清洗后，P5重悬于含有25% Nycodenz的12 mL溶液中，然后置于非连续Nycodenz梯度（5 mL 34%的以及8 mL 30%的）的顶部并覆盖上8 mL 23%及3 mL 20%的Nycodenz。52,000g离心90分钟后，从25-30%的界面间回收线粒体。在15,000 g离心20分钟前，将该组分收集后稀释至终浓度含200 mM甘露醇及50 mM蔗糖的缓冲液。进而将得到的含有纯线粒体的沉淀块清洗后储存起来。
可溶性组分S5于34,000 g离心30分钟后得到沉淀块（P6）与含有轻微体的可溶性组分（S4）。S4于124,000 g离心后将细胞质从微体（沉淀块）中分离出来并储存。P6与之前离心得到的轻微体混合后稀释至终浓度含0.25 M蔗糖及0.015 M CsCl的缓冲液中。将该溶液置于1.3 M蔗糖溶液顶部并于237,000 g离心2小时。这会使粗面内质网（沉淀块）与0.25-1.3 M界面处的滑面内质网分开。该可溶性组分用0.25 M蔗糖1:1稀释后于124,000g离心60分钟。将滑面内质网从沉淀块中回收出来并储存 。
#End#
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