摘 要:本文对从桑叶提取黄酮类化合物的各种方法, 如醇提法 、 微波法 、 超临界 CO 2萃取和大孔树脂吸附法等进行系 统的叙述; 同时对桑叶中黄酮类化合物的分析方法, 包括分光光度法与荧光光度法 、 高效液相色谱法 (HPLC ) 、 高效毛细 管电泳法 (HPCE ) 和微乳薄膜层析法进行概述和比较 。
关键词:桑叶; 黄酮类化合物; 测定; 含量 中图分类号:S882.2
桑叶是桑科桑属 (Morus L. ) 植物桑树的叶子, 是 常用中草药之一 。 研究表明, 桑叶具有降血糖 、 降血 脂 、 降血压 、 抗衰老 、 抗肿瘤 、 抑菌等药理作用 。 其化 学成分有黄酮 、 生物碱 、 维生素和许多人体所需的氨 基酸 。 其中, 黄酮类是主要有效成分之一 。 桑叶中含 有芸香苷 、 槲皮素 、 异槲皮素 、 二氢山茶碱等黄酮类 化合物, 约占干叶重的 3.3%, 是植物茎叶中黄酮类化 合物含量较多的植物 。 桑叶中黄酮类成分的深入 研究对桑叶黄酮的开发利用有重要意义 。 近年来, 桑 叶黄酮的含量测定方法以及提取工艺的研究有了新 了进展, 为桑叶黄酮的提取利用提供了参考 。
1桑叶黄酮含量检测研究
1.1分光光度法与荧光光度法
分光光度法是测定桑叶黄酮含量的传统方法, 原理为, 铝离子与黄酮类化合物作用后, 生成的黄酮 铝络合物为黄色,黄色的深浅与黄酮量呈一定比例 关系, 测定吸光度, 计算黄酮类化合物的含量 。 刘利 等通过甲醇提取 、 硝酸铝显色 、 分光光度法测定, 分 析了华桑种质资源桑叶总黄酮含量,同时进行了稳 定性 、 重复性 、 精密度和回收率试验检验 。 结论是该 方法操作简便 、 结果可靠 、 重复性好,黄酮的含量测定 。 同样应用此原理, 用荧光光度计 测定桑叶总黄酮量,以在 436nm 和 483nm 处为激 发和发射波长, 检出限可达到 1.36×10-9mol/L, 该方 法灵敏度高, 操作简便, 准确性 、 重现性 、 线性关系 、 稳定性较好, 可推广用于植物中总黄酮的测定 。 多数 研究表明,这两种方法在加入硝酸铝显色后稳定性 较差, 要及时测定 。 但也有人认为是桑叶组分之间的 影响, 导致稳定性较差 。
1.2高效液相色谱法 (HPLC )
近年来, 高效液相色谱法 (HPLC ) 逐渐被运用到 桑叶黄酮及其苷类化合物的检测中 。 刘杰等 将样品 中的黄酮苷经酸水解为苷元后,采用 HPLC 法检测 总黄酮苷水解成的槲皮素和山奈酚,研究盐酸量与 总黄酮苷量比例 、 水解温度 、 时间等条件对桑叶黄酮 苷水解的影响, 并优化水解条件 。 结果显示:水解的 条件直接影响分析结果 。 桑叶提取物中加入甲醇 -25%(V/V) 盐酸混合溶液 (4∶ 1, V/V) , 使盐酸量与总黄 酮量的比例为 0.72, 80℃ 水浴回流 1h 水解效果最 好 。 该方法有良好的线性关系 、 精密度和重现性, 加 样回收率高, 方法稳定可靠, 满足测定桑叶提取物总 黄酮苷元的要求 。 刘丽芳等 采用反相高效液相色谱 法 (RP-HPLC ) 测定桑叶中黄酮类成分含量, 色谱柱 为 Merek RP-C 18(250mm ×4.6mm , 5μm ) , 流动相为 甲醇 -0.5%的磷酸溶液梯度洗脱, 检测波长 358nm , 流速 1mL/min, 柱温 25℃ 。 此方法法操作简便, 检测 灵敏, 有很好的重复性和稳定性, 能一次性测定桑叶 中芦丁与槲皮苷等 2种有效成分的含量 。 吴好好等 同样采用反相高效液相色谱法 (RP-HPLC ) , 以 Zor -bax SB C 18(250mm ×4.6mm , 5μm ) 为分离柱, 90%乙腈 -0.2%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,流速 1.0mL/min, 检测波长 358nm , 测定了绿原酸 、 芦丁 和异槲皮苷的含量 。 桑叶中黄酮类成分种类较多, 两 种方法均采用梯度洗脱法将待测成分与其他成分达 到了很好的分离, 并可对其他成分进行定量测定 。 测 定结果准确, 重现性好, 为桑叶黄酮类成分含量测定 和质量控制提供了很好的依据 。
1.3高效毛细管电泳法 (HPCE )
高效毛细管电泳 (HPCE ) 技术是一种高效分离 分析技术, 具有灵敏度高 、 柱效高 、 分析速度快 、 所需 样品量少 、 溶剂消耗少和抗污染能力强等优点, 在中 药有效成分分析 、 指纹图谱研究方面显示出良好效 果 。
张军等 采用高效毛细管电泳 (HPCE ) 法建立不 同桑品种桑叶黄酮类化合物的指纹图谱,电解质溶 液由以 10mmol/L磷酸二氢钠 -20mmol/L的硼砂溶 液 (pH 8.62) 作缓冲液, 在 25℃ , 20kV 的压力下进行 电泳 。 245nm 波长处检测, 线性关系良好, 在 20min 内完全分离 。 上述条件下, 桑叶成分得到了较好的分 离, 符合定量测定和定性研究的要求 。 该方法具有较 好的分离效果和良好的精密度,可应用于桑叶质量 控制与评价,同时也可为桑品种的真伪鉴定提供参考 。
1.4微乳薄膜层析法
李升锋等 研究了桑叶中黄酮类化合物的微乳 薄膜层析分离方法 。 用 10%甲酸调酸, 以含水量 70%的十二烷基硫酸钠 -正丁醇 -正庚烷 -水微乳液为展 开剂, 在聚酰胺薄膜上使桑叶黄酮类化合物分离 。 分 离结果表明:桑叶乙醇提取物中分离出 12个斑点, 没有从桑叶乙醇提取物中分离到槲皮素,与用正丁 醇 -乙酸 -水为展开剂的常规层析方法相比,微乳薄 膜层析法的检测灵敏度更高, 分离效果更好, 可用于 桑黄酮成分的分离 。
1.5桑叶黄酮含量分析
含量测定结果表明,不同种质资源和不同生长 时期桑叶的总黄酮含量差异极显著 。 中国的桑属植 物有 15个种 4个变种, 其中, 华桑 Morus cathayana Hemsl . , 长穗桑 Morus wittiorum Hand-Mazz . 等野生 种质资源的桑叶总黄酮含量较高 。 桑叶中的黄酮类 物质含量以桑树停止生长后至降霜前的一段时间内 的含量为最高 。 对于同一株桑树上的各枝条来说, 生 长前期基部叶片和中部叶片低于顶部嫩叶,顶部嫩 叶的黄酮类物质含量高出基部叶片和中部叶片很 多,这与植物表现的黄酮类物质在幼嫩部位含量较 高是一致的。
2桑叶黄酮的提取工艺研究
桑叶黄酮类化合物的提取方法有醇提法 、 微波 法 、 超临界 CO2萃取 、 大孔树脂吸附等 。
2.1醇提法
醇提法是桑叶黄酮提取的传统方法 。 该法所需 提取时间短, 提取效率高, 适于工业生产 。 杨虎等 采 用正交实验研究表明,用乙醇提取桑叶黄酮的最佳 工艺条件为:在 85℃ 下, 乙醇浓度 80%, 料液比 1∶ 30, 回流提取时间 1.5h , 提取 3次 。
正交试验研究乙醇提取桑叶黄酮 。 得出最佳提取条 件为, 80℃ , 乙醇浓度 75%, 料液比为 1∶ 15, 浸提 2次, 每次提取 1h 。 章华伟等 在单因素试验基础上, 采用响应曲面法优化了桑叶黄酮提取工艺条件 。 最 优工艺条件为:乙醇体积分数 71.75%、 提取温度 67.1℃ 、 料液比 23.2∶ 1、 提取时间 150min 、 提取 2次, 结果与模型预测值相符 。 多数研究表明, 一定浓度的 乙醇提取桑叶中黄酮类化合物的工艺条件比较类 似, 由于不同桑叶的总黄酮含量和具体成分不同, 工 艺条件不尽相同 。 因此, 在实际生产中, 需要根据不 同原料调整提取工艺 。
2.2微波法
微波萃取技术是桑叶吸收微波能后通过偶极子 旋转和离子传导两种方式同时加热,加剧了体系中 分子的碰撞频率,使黄酮分子容易从桑叶内部扩散 到萃取溶剂中, 大大缩短了加热时间, 提高了萃取效 率, 尤其适合极性分子的萃取 。 陈菁菁等研究得出 微波法萃取黄酮类成分的最佳工艺条件为:在 60℃ 下, 乙醇浓度 70%, 料液比 1∶ 12, 萃取 20min , 其中提 取溶剂对结果有显著影响 。 微波萃取法在提取时间 、 溶剂用量及得率等方面明显优于传统的醇提法 。 微波可使桑叶中的细胞膜和细胞壁破裂,使提 取溶剂进入细胞, 溶解并释放出细胞内物质 。 随着微 波化学新技术的发展,新的微波破壁提取分离技术 已经应用于各种天然有机物的提取工艺研究 。 李宇 亮等通过微波破壁超声浸提, 732树脂进行分离纯 化提取桑叶中的黄酮, 最佳工艺条件为:微波浸提提 取黄酮可用水作为溶剂, 料液比为 1∶ 8, 浸润后, 微波 破壁 3次, 每次 30s , pH 值为 5.5, 超声提取 30min (功率 1800W ) , 桑叶黄酮提取率为 96.9%, 得率为 0.874g/100g , 纯度达到 95.13%。 微波强化提取桑叶 中黄酮的技术路线易行 、 所需设备简单 、 产品的得率 高 、 纯度高 、 成本低 、 适合于工业化生产, 具有重要的 经济价值和社会意义 。
超声 -微波协同提取是近年发展起来的一种新 方法, 具有快速 、 高效 、 环保, 安全等特点 。 高中松等用浓度为 70%、 按料液比 1∶ 15的比例的乙醇浸泡桑叶 3h 。 再用超声提取 45min , 桑叶中总黄酮类物质 的提取率可达 2.18%。 李莉等用超声 -微波协同提 取桑叶总黄酮,通过单因素试验确定影响总黄酮提 取的主要因素及最佳水平范围后,再通过正交试验 确定影响总黄酮提取的主要因素的最佳水平 。 总黄 酮提取的最佳条件为:超声 -微波提取功率为 400W , 乙醇浓度 65%, 料液比为 1∶ 10, 提取时间为 12min , 在此条件下桑叶总黄酮的提取率可达 3.07%。 超声 -微波协同提取可降低乙醇的使用量, 缩短提取时间, 为生产应用提供了参考 。
2.3超临界 CO 2萃取超临界 CO2萃取是一种更有效的萃取方法, 是 近年来发展应用的一种集萃取 、 分离于一体的技术, 具有效率高 、 速度快 、 选择性好 、 无残留溶剂且适用 于热敏物质等优点。 王昕宇等用单因素试验和正交设计法研究了压力 、 温度 、 CO2流量以及萃取剂用 量对超临界萃取的影响,并与超声波提取法进行了 比较 。 结果表明,影响提取率的主要因素依次是压力 、 萃取剂用量 、 CO2流量和萃取温度 。 萃取的优化条 件 (以 300g 样品计 ) 为压力 35MPa 、 萃取剂用量 200mL 、 CO 2流量 10kg/h及温度 45℃ , 萃取物中黄 酮含量达到 7.68%, 其效率远优于传统提取方法 。
2.4大孔树脂吸附大孔吸附树脂是 20世纪 70年代发展起来的有 机高聚物吸附剂 。 它具有良好的大孔网状结构和较 大的比表面积, 通过表面吸附 、 表面电性或形成氢键 而起到较好的吸附作用 。 大孔吸附树脂在中草药有 效成分的分离 、 纯化中的应用越来越受到人们的重 视 。陈菁菁等研究表明, NKA-9型树脂对桑叶总 黄酮的吸附分离性能最好, 上样浓度 20mg/mL, 饱和 吸附量为 43.4mg/g, 70%乙醇洗脱, 洗脱率为 98.2%, 总黄酮纯度达 58.2%, 朱欣婷等报道 D140型大孔 树脂能更有效的纯化桑叶总黄酮, 最佳工艺为:以浓 度约为 3mg/mL的桑叶总黄酮上样,上样速率控制 在 2BV (柱床体积 ) /h左右, 上样体积为 4.5BV , 再 用 3BV 、 70%乙醇, 以 1BV/h的速率洗脱, 获得的桑 叶总黄酮的纯度为 41.1%。 花蕾等采用 AB-8树脂 从桑叶水提液中分离黄酮类化合物,上样桑叶总黄 酮水溶液浓度为 0.613mg/mL, pH 值为 4,流速为 2 BV/h, 70%乙醇为洗脱剂, 树脂每使用 3次进行一次 再生, 黄酮含量可提高 1倍以上 。 陈建明等采用 AB-8树脂, 最终得到的总黄酮的含量为 44%, 王俊 等采用 H103树脂, 桑叶总黄酮纯度达 76.33%。 与一般方法相比,应用大孔树脂分离纯化桑叶总黄 酮, 能得到较高纯度的总黄酮 。
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