【微生物鉴定】影响微生物鉴定结果的主要因素

1、检测前因素

 

1.1  培养基的影响对于MALDI-TOF MS微生物鉴定系统来说，不同培养基培养导致菌株肽质量谱有所变化。某些菌种的肽质量谱对不同成分的培养基较为敏感，肽质量谱会有较大差异，。大多数的菌种对不同成分的培养基产生肽质量表达谱变化没有特异性，不影响菌种的鉴定。培养基对鉴定结果的影响，主要在于菌体蛋白样本制备过程中是否混杂有培养基的成分(主要为盐离子)，导致离子抑制，降低了检测灵敏度，样本谱图采集困难(激光强度需提高，谱图叠加数量增加)、信号噪音大、峰数目少，难于鉴定。因此，培养基的物理性质，即固体、半固体、液体是微生物质谱鉴定所需要关注的。不同物理形态的培养基培养后，菌株的前处理方式不同。固体表面培养的菌株，按乙醇/甲酸法制备样本即可;液体及半固体培养基培养的微生物，洗涤菌体是有效降低培养基成分影响的有效途径。洗涤不充分，培养基残留成分会影响质谱峰图;多次洗涤尽管可以去除杂质，但费时、影响检测效率。洗涤一次后离心处理，即可获得理想的肽指纹图谱。因此，液体、半固体培养的微生物，采用PBS洗涤一次后预提取蛋白，即可完全可以达到质谱检测的要求。

 

1.2  培养环境因生长速度不同，菌株培养时间的选择应根据培养经验，选择菌株菌落生长最为茂盛时，比如分枝杆菌3d、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌为1d，室温存储或微需氧培养时间过长，严重影响鉴定结果;4℃条件，存放8d不影响菌株识别。每次培养都保持一定的pH MALDI-TOF MS值及固定的生长率是很难实现的，不同pH值的培养基会影响菌株的生长速率、影响菌株的细胞形态，但对用于种、属鉴定的肽质量谱，即用于菌株识别的高丰度蛋白无影响。不同的培养温度(26℃～37℃)会影响菌株的表型特征，高温范围32~37℃的肽质量谱非常相似，不影响鉴定;低温范围26℃，肽质量谱会有较大差异。建议待鉴定菌株的培养温度与建库菌株的培养温度保持一致。

 

2、检测中的因素

 

1.1  样本制备MALDI-TOF MS质谱鉴定样本的基本前期处理有两种方式，直接涂布法与预提取法。预提取法根据不同的菌种类型有不同的处理方式，如：

 

(1)适用于大部分微生物的乙醇/甲酸提取法：取适量(5～10mg)样品，加入300μL水，仔细混匀，再加入900μL无水乙醇、混匀;高速(10000～16000r/min)离心2min，弃去上清;加入50μL70%甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，高速离心2min，吸出上清备用。

 

(2)适用于灭活含孢子体微生物的80%三氟乙酸(trifluoroacetic acid，简称TFA)提取法：取适量(5～10mg)样品，加入50μL80% MALDI-TOF MS，反复吹打至样品完全溶解或变性，放置10～30min，加入150μL水和200μL乙腈，混匀，高速离心2min，吸出上清备用。

 

(3)适用于灭活不含孢子体的微生物的50%乙腈/2.5%TFA  MALDI-TOF MS提取法：取适量(5～10mg)样品，加入100μL水，仔细混匀，再加入100μL5%   TFA/乙腈，仔细混匀，高速离心2min，吸出上清备用。

 

(4)适用于酵母和厚壁微生物的海沙/丙酮-乙醇/甲酸提取法：取适量(5～10mg)样品至研钵中，加入适量海沙和500μL丙酮，仔细研磨至丙酮完全挥发。加入500～700μL20% MALDI-TOF MS甲酸，短时匀浆;吸出300μL溶液，加入900μL无水乙醇，仔细混匀，高速离心2min，弃去上清;加入50μL70%甲酸，仔细混匀，再加入50μL乙腈，仔细混匀，高速离心2min，吸出上清备用。目前，直接涂抹法及预提取法均有使用。样品的处理方法对基质和样品的结晶状态影响很大。对于直接菌落涂抹法，操作较为简便。但无论是基质直接覆盖菌落还是与菌落混合，所产生的结晶成斑点状、不均一，重复性较差；谱图峰数量较少，并且样本量对谱图质量有显著的影响;对于操作者来说，菌量的控制很难均一，导致谱图的重复性不理想。预提取法样品与基质的结晶均一，具有很好的重复性;肽质量谱具有很好的重复性，峰数目及质量均好于直接涂抹法。

 此外从生物安全角度来说，直接涂抹法为活菌检测，易造成环境及人员污染，存在安全性风险;预提取方法处理后，普通细菌及带荚膜的细菌可被灭活，带芽胞的细菌乙醇/甲酸法处理后，适宜的条件下可正常生长，80%TFA法处理后可完全灭活。

 

2.2  标本直接检测中样本量的影响 MALDI-TOF MS技术对置于靶板上的细菌的最低检测限约为1×104～1×106CFU/mL。直接检测阳性血培养瓶的细菌浓度需要1×107CFU/mL，直接检测中段尿样本中病原菌至少需要的细菌数量是1×105CFU/mL。若直接检测血液以及中段尿等临床样本中的病原菌，首先必须富集细菌。细菌量1×105CFU/mL的尿液样本进行直接的MALDI-TOF MS鉴定，尿液样本经过差速离心法处理后，有87.5%～92.0%的敏感性。多数情况下细菌数≥1×105CFU/mL的样本能产生更高的鉴定分数，而随着样本中细菌数的降低，鉴定成功的比例和鉴定分数也在下降，当菌落数<1×104CFU/mL时，不能得到可靠的鉴定结果。

 

2.3  样品稳定性、样品保存预提取方法制备的蛋白样本，可于4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存3个月;样本真空冻干后-20℃或-80℃保存1年，可正常使用。点样、与基质结合的样本点，根据不同的前处理方法及菌种的差异，可保存2d～1周。部分特殊样本需在点样后2h内完成检测。

 

2.4  手动及自动蛋白谱图获取 MALDI-TOF MS系统具备手动及自动采样两种采样方式。自动采样是在调整好的一致性的参数下进行谱图数据采集，速度快、自动化、无需人员看守;对于不同的样本点，蛋白量不一致、结晶状态不一致，而自动采样采用一致的采集路径、统一的激光强度、固定的谱图叠加次数，对于质量差的样本点会有不理想的谱图，导致某些点鉴定不出或得分较低。手动谱图采集，可随时调整参数，便于在整个点样点范围内采集到理想的数据。针对临床使用，建议对于大批量的数据首先采用自动采样程序进行采集，没有鉴定或得分较低的样本点，采用手动模式进行数据补采。

 

2.5  结果判定标准目前商业化的微生物质谱识别系统都有各自的属、种判读标准，具体可参见各系统的操作说明。值得注意的是，为避免假阳性，一般商业质谱的判定标准较为严格，使用者可根据自己的数据库系统，在使用经验积累及科研评估的基础上，根据不同菌种特性调整判定值。

 

2.6  混合感染样本对于 MALDI-TOF MS微生物检测系统，混合样本的检测是难题。混合菌蛋白丰度、肽质量谱差异性以及特异性均会影响鉴定结果，可能会检测出≥2种菌种，也可能只能检测出优势菌，或得到无法鉴定的结果。

文章来源：蒲公英

 

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