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【解救科研小白】Western Blot那些事儿

南方医科大学校研究生会 2020-05-19 07:17:38

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        Western Blot是我们实验室中最常见的实验,也常常是科研小白要经过的第一关,看到小白们时而抓狂,时而蓝瘦,小编们经过不断的实践和阅读大量的老司机秘籍,将与大家分享交流WB那些事儿。

         首先我们要了解WB的原理:Western blot是将蛋白样品经SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)后,在电场作用下分子量不同的蛋白因此分离开,然后根据Marker上的分子量标识切取目的蛋白,再通过湿法或半干法将胶上的蛋白转移至NC/PVDF膜上,经过一抗的特异性结合后,二抗再与一抗结合起到放大检测结果的效应,二抗带有酶或同位素标记,经过底物显色或是放射自显影以检测电泳分离的特异性蛋白成分。

WB实验主要有两种方法:直接法和间接法(目前间接法多用)

Western blot的基本流程:

①  蛋白样品的制备;

②  蛋白定量;

③  SDS-PAGE(蛋白电泳);

④  转膜;

⑤  封闭;

⑥  抗体杂交(一抗和二抗);

⑦  检测

 1. 蛋白样品的制备

 蛋白样品的制备(以细胞样品为例)(在冰上进行)

1)取出孵育箱中的细胞,PBS液洗2次,吸干;

2)加入裂解液(RIPA buffer和PMSF混合液)裂解液的量主要依据细胞的密度和培养器皿的面积来确定;(1ml RIPA配10ulPMSF:均在-20℃保存);

3)放冰上用刮子刮3分钟,尽可能把细胞刮下来;

4)吸出培养瓶内和刮子上的液体至1.5ml的EP管中;

5)漩涡震荡(或是用手震荡)30s/次,每5min/次,共5次(使裂解更充分)期间放4度冰箱;

6)放4℃离心机13.3×10³rpm(最大转速)离心大于15min;

7)吸取上清液(含蛋白)于EP管中,分为两部分:用于测蛋白浓度,其他用于电泳;

8)加Loading buffer(量为1/4的裂解液的体积),煮蛋白,5-8min,储存于-20℃,或是分装储存于-80℃。

RIPA:细胞裂解液,PMSF:抑制蛋白酶和磷酸酶

2. 蛋白定量

        蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有两种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)和BCA法。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。

①Bradford法原理:考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比;

②BCA比色法原理:碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂(4,4’-二羧酸-2,2’-二喹啉钠)形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。

3. 电泳分离

电泳分离(具体参照SDS-PAGE电泳方法)

①配胶:有分离胶/积层胶(下层)和压缩胶(上层)之分;根据目的蛋白的分子量选择分离胶的配方;需要配方请后台回复“配方”

②准备电泳液/电泳buffer;

③上样:根据蛋白定量计算上样量,10-20ug;

常见注意事项如下

4. 转膜

       杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。

      蛋白质常用的转移方法主要有两种:槽式湿转和半干转,前者操作容易,转移效率高;而后者适用于小分子蛋白的转移,所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。

①.将胶浸于转膜液中平衡10min。
注意:如检测小分子蛋白,可省略此步,因小分子蛋白容易扩散出胶。

②.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片,放入转膜液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。

③.装配转移三明治:海绵+3层滤纸+胶+膜+3层滤纸+海绵,每层放好后,用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。

④. 将转移槽置于冰浴中,放入三明治(黑色面对黑色面),加转膜液,插上电极,100V,1h(电流约为 200-250mA)。注意:应再次检查三明治和电极是否装配正确,电源是否接通。

⑤.转膜结束后,切断电源,取出杂交膜

5.免疫杂交与显色

①.用25 ml TBS 洗膜5min,室温,摇动;

②.置膜于25 ml 封闭缓冲液中封闭1h,室温,摇动封闭剂:5%脱脂奶粉或BSA(用TBST配);

③.15ml TBS/T洗3次(5 min/T);

④.加入合适稀释度的一抗,室温孵育1-2h或 4°C过夜,缓慢摇动;

⑤.15 ml TBS/T洗3次(10min/T);

⑥.加入合适稀释度的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗,室温孵育1h,缓慢摇动;

⑦.15 ml TBS/T洗3次(10min/T);

⑧.15 ml TBS洗1次;

⑨.蛋白检测(显色法或发光法,按相应试剂说明操作)。

总的workflow 可以用下图概括

参考资料:

1.  生物学霸:献给初学者:western blot 操作步骤详解(上)、(下);

2.  蛋白穿越之旅:Western Blot技术;

3.  Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答);

4.  蛋白定量检测方法;

5.  五年western-blot-实验经验总结

南方医科大学校研究生会新媒体部

责任审核人:丁永桢

责任编辑:曾东强

投稿:smu_xyjsh@163.com

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