心肌肌钙蛋白(cTn)你了解多少?

无论是溶栓、经皮冠脉介入（PCI），还是冠脉搭桥（CABG），都是风险极大的治疗手段，所以冠心病，急性心肌梗塞等诊断的正确性就显得尤为重要。因此，心肌损伤标志物是急性冠脉综合征（ACS）诊断和危险分层的重要手段。长期以来临床上一直致力寻找一种高敏感性和高特异性血清诊断指标，以期提高诊断正确性。肌钙蛋白（troponin，Tn）在临床实践中成为目前公认的高敏感性和高特异性指标，为所有指南所推荐。

1、肌钙蛋白（Tn）的来源和分类

肌钙蛋白（Tn）是肌肉收缩的调节蛋白。心肌肌钙蛋白（cardiactroponin，cTn）是由三种不同基因的亚基组成：心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌肌钙蛋白I（cTn I）和肌钙蛋白C（TnC）。目前，用于ACS实验室诊断的是cTnT和cTnI。

肌钙蛋白T（TnT）分子量为 37KD，是原肌球蛋白结合亚基。有三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白T（sTnT）包括快骨骼肌型和慢骨骼肌型，此外还有心肌型。心肌肌钙蛋白T（cTnT）的大部分是以C-T-I的复合物形式存在于细丝上，6%-8%以游离的形式存在于心肌细胞浆中。因cTnT与骨骼肌TnT的基因编码不同，骨骼肌中无cTnT的表达。cTnT相对于两种骨骼肌亚型有40%的不同源性。cTnT分子稳定、亲水、特异性抗原决定簇的反应性好。目前所用的单克隆抗体为对心肌特异的捕捉抗体和标记抗体。

TnI（肌钙蛋白I）存在三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）中存在快骨骼肌型和慢骨骼肌型，它们具有相似的分子量（20KD），但二者之间的氨基酸序列约存在40%的差异；第三种为心肌型。心肌肌钙蛋白I（cTnI）与骨骼肌型的氨基酸序列也存在40%的差异。但人的cTnI氨基末端比sTnI多31个氨基酸，使其分子量达到22KD，这种独特的顺序使之具有较高的心肌特异性，有助于制备相应的单克隆。cTn是以cTnI-C-T复合物和游离cTnI形式存在于心肌细胞中，心肌损伤时释放到血循环中后，cTnI-C-T可进一步分解为cTnI-C复合物和游离cTnI。故血循环中除cTnI C-T、游离cTnI外还有cTnI-C，而且cTnI-C是其在血液中的主要形式。其代谢产物由肾脏排出体外。

TnC分子量为18KD，是Ca2+结合亚基，每个分子结合2个Ca2+。心肌和骨骼肌的TnC结构相同。

由于cTnT和cTnI与骨骼肌中的异质体分别由不同基因编码，具有不同的氨基酸顺序，有独特的抗原性，故它们的特异性要明显优于CK-MB同工酶。

心肌以外的肌肉组织出现损伤或疾病时，CK和CK-MB可能会升高，而cTnT和cTnI则不会超过其临界值。由于它们在正常血清中含量极微，在AMI时明显增高，且增高倍数一般都超过总CK和CK-MB的变化。

cTnT和cTnI由于分子量小，发病后游离的cTn从心肌细胞浆内迅速释放人血，血中浓度迅速升高，其时间和CK-MB相当或稍早。虽然肌钙蛋白半寿期很短（cTnT 2小时，游离cTnI的半寿期据报道为2h～5d不等），但其从肌原纤维上降解的过程持续时间很长，可在血中保持较长时间的升高，故它兼有CK-MB升高较早和LD1诊断时间窗长的优点。故目前cTn已有逐渐取代酶学指标的趋势。

2、肌钙蛋白I 和肌钙蛋白T 有么区别？

1992年第一份肌钙蛋白I商业检测试剂在临床推广，不久肌钙蛋白 T 检测试剂也开始在临床应用，在随后十余年引发了一场旷日持久的大争论—到底肌钙蛋白 T 和肌钙蛋白 I 孰优孰劣？

早期曾有研究观察到在慢性肾功能衰竭患者中经常出现肌钙蛋白 T 增高却不一定有急性冠脉综合症。随后提出了几个可能的学说：（1）慢性肾功能衰竭患者中肌钙蛋白 T 在横纹肌表达再分布，（2）抗原交叉反应，（3）慢性肾功能不全引发心肌微损害有关。第一个假说很快被 cTnT 阵营否定，有学者用 PCR 检测否定 cTnT 在慢性肾功能衰竭患者表达异常。随着第二代肌钙蛋白 T 检测方法推出抗原交叉反应得到较好解决。慢性肾功能不全心肌微损害也同样会引起肌钙蛋白I 增高。

目前倾向认为cTnI仅在心肌组织中表达【1】，而cTnT特异性略低，会在某些病变的骨骼肌中瞬时表达【2】。但是相对而言，有个问题显得更加重要，无论是 cTnT 或 cTnI，自肌钙蛋白检测方法问世以来，没有经过一个垄断的专利生产过程。不同厂家、不同免疫检测方法，可谓五花八门，始终未能形成一个统一全球质量标准，只有企业质量标准。

不同厂家试剂盒可比性较差，甚至无法比较。这可能成为两大阵营论战当中诸多结论相互矛盾主要原因。由于巨大的市场份额和不同商业利益，要求不同厂家按照统一模式生产,目前看来并不现实。

3、为什么cTnI标准化这么难？

由于仅一家生产厂商拥有cTnT生产专利，因此人们对cTnI的生产应用兴趣大增。尽管cTnI被认为是心肌损伤诊断的金标准，但是至今cTnI检测仍然没有实现标准化。目前FDA至少已批准8家生产厂商的共16种cTnI检测试剂。在临床应用中发现，这些cTnI检测试剂的测定值之间存在着差异，不同的cTnI分析方法对同一份标本的检测值最大可相差30余倍，这使得各种方法的参考范围、分析干扰、分析变异、诊断窗口期以及诊断和预后的临界值等出现不同程度的差别，给临床应用和评价带来一定困扰。

各种cTnI检测试剂差异的最大原因是不同试剂所用的抗体的表位特异性不同。由于cTnI存在自身抗体和若干转译后修饰，因此，精心验证抗体的性能对于获得可靠准确的样本测试结果至关重要。影响cTnI免疫检测的干扰因素主要包括：cTnI的蛋白水解；cTnI的磷酸化状态；肌钙蛋白I、C和T之间形成复合物；样本中存在肝素；cTnI特异性自身抗体以及异嗜性抗体等。试剂中的单抗或多抗不同程度地受上述因素的影响。

蛋白质降解

cTnI是一种极其不稳定的分子，很容易发生蛋白质降解。cTnI 最稳定的部分位于氨基酸残基30至110之间【3】。普遍认为在坏死组织和血液中，cTnI 分子的这一部分因受到 TnC 保护而免遭内源蛋白酶降解。

有关患者血液中 cTnI 降解程度的信息之间多少存在一些出入。但几乎可以肯定，cTnI 分子上未受 TnC 保护的N-端和 C-端区域至少被部分降解，尤其是在患者出现症状 20 小时或 20 小时以后所采集的样本中。

磷酸化作用

cTnI的第22位和第23位的两个丝氨酸可在体内被蛋白激酶A磷酸化。这意味着，四种形式的蛋白（一种未磷酸化蛋白，两种单磷酸化蛋白和一种双磷酸化蛋白）可并存于患者的细胞中并在发生MI之后出现在血样中【4】。cTnI 的磷酸化作用会改变蛋白的构型并改变它与其他肌钙蛋白的相互作用。

磷酸化作用还会改变肌钙蛋白与某些抗 cTnI 抗体的相互作用，如 22B11。mAb 22B11 只能识别未磷酸化形式的cTnI，并且不会与该抗原的单磷酸化或双磷酸化形式发生反应。22B11可用于夹心免疫测定法中未磷酸化 cTnI的定量检测。还可以用于 Western blotting 中未磷酸化 cTnI 的定量或半定量免疫检测。

cTnI 与 TnC 和 cTnT 形成的复合物

在心肌细胞中，cTnI与cTnT和TnC形成三元肌钙蛋白复合物。许多科学机构都已证实，在 AMI 患者血液中，cTnI 仍与TnC以复合物形式存在。与 TnC 的结合改变了 cTnI 的构象，导致部分 cTnI 表面被 TnC 所覆盖。因此，游离形式的 cTnI 和复合物形式的cTnI 有着不同的免疫学特性。由于 TnC 结合可能挡住某些区域，因此针对这些区域上的表位生成的抗体可能无法识别临床样本中以蛋白质复合物形式存在的 cTnI。由于血液中多数（尽管不是全部）cTnI 分子都与 TnC 形成复合物，因此在检测系统中使用的 cTnI 特异性抗体能够识别 cTnI-TnT 二元复合物中的 cTnI 是至关重要的。

肝素的作用

肝素在临床实践中作为抗凝剂被广泛使用。几乎所有疑似急性心肌梗塞患者在入院后的第一时间都会被注射肝素。血样通常也会采集到肝素管中。

肝素是一种带负电荷的分子，很容易与带有大量正电荷的cTnI（等电点约为 9.9）发生相互作用。我们已经证实，部分抗 cTnI 单抗对含有肝素的样本较为敏感，会对含有肝素的样本给出较低的信号【5】。

自身抗体

针对 cTnI 的自身抗体不但存在于有心脏问题的患者血液中，在看似健康的个体的血液中也同样存在【6-8】。现已证实，自身抗体可对某些检测系统中 cTnI 的识别产生负面影响，尤其是当自身抗体浓度较高时，可导致患者血液中 cTnI 的测量值严重偏低。

异嗜性抗体和HAMA影响

      当人类长期与动物来源的产品接触时，会产生异嗜性抗体。其中典型的有人抗鼠抗体（HAMA）、人抗兔抗体、人抗山羊抗体、人抗绵羊抗体等。对于免疫诊断而言，影响最普遍的莫过于HAMA，因为大多数的免疫学诊断试剂均使用了鼠单抗。HAMA可能会对检测造成假阳性或假阴性结果【9-10】。假阴性结果会延正确诊断，若误诊为性命攸关的疾病（如AMI）时，甚至会造成非必要的入院【11】。

cTnI检测对HAMA异常敏感，因为诊断的cut-off值非常低，即使是AMI患者，其血液cTnI浓度也很低。有研究显示，在疑似MI患者人群中，肌钙蛋白升高的病例中HAMA造成的假阳性概率为5.5%，在肌钙蛋白升高同时肌酸激酶正常的病例中，HAMA造成的假阳性概率为14%【12】。

4、高敏心肌肌钙蛋白（hs-cTn）的概念和临床应用

什么是hs-cTn？

在20世纪90年代末期，当时的cTnI和cTnT试剂可以检出患者体内ng/mL（µg/L）级的肌钙蛋白。这种灵敏度水平的试剂仅能在缺血症状和胸痛发作3-6小时后可靠地检测到肌钙蛋白。这使得肌钙蛋白只能作为AMI的晚期标志物。传统的心肌肌钙蛋白（cTn）检测方法灵敏度、精密度相对不高，血循环中的 cTn 如果浓度较低，便难以被检测发现，基本无法在表面健康人群中检测出 cTn。在缺血症状或心电图改变不典型时，这有可能导致延迟诊断甚至误诊，不利于早期诊断、风险评估和预后判断。

目前的商品化高敏肌钙蛋白试剂相比于1987年的第一代肌钙蛋白试剂，分析灵敏度提高了1000倍以上（10ng/L VS. 10ng/mL）。hs-cTn有助于探查既往易被漏诊的微小心肌损伤、更早期诊断AMI、更合理筛查心血管事件高危患者，优化临床治疗决策与预后评估。那什么试剂才能称之为高敏？评估检测性能是合理选择cTn检测方法的重要步骤。为更明确评估hs-cTn检测方法，美国食品药品监督管理局(FDA)曾与美国的心脏病学、急诊医学、检验医学等领域的专家以及主要的hs-cTn生产厂商共同讨论如何设立判断标准。

高敏心肌肌钙蛋白（hs-cTnI）的检测系统需要满足以下两条标准：1、参考值上限第99百分位值对应的分析不精密度（CV%，变异系数）应≤10%；2、在表面健康人群血液中检测到cTn的检出率≥50%（最佳状态＞95%）。目前，有5种hs-cTnl及1个hs-cTnT试剂能满足上述标准，但只有Roche的hs-cTnT检测在全球范围内使用（美国除外，目前为止FDA未批准），其他几种hs-cTnl试剂在2014年会陆续在国内注册批准而投入临床应用。同时，专家共识建议单位要统一，hs-cTn的检测结果应以ng/L作为报告单位。

在临床实践中如何使用hs-cTn？

早期诊断

随着hs-cTn检测的应用，ACS患者在发病后1～3h或就诊即刻就可检测到增高的cTn。有了hs-cTn检测，可更快速地“诊断”和“排除”心肌梗死。

图2 疑似ACS患者的评估

⚑其他心脏疾病包括心肌炎、Takotsubo心肌病或充血性心力衰竭等；非心脏疾病是指胸部疾病，如肺炎或气胸。

⚑0h肌钙蛋白水平或系列检查绝对变化值越高，心梗的可能性越大。

⚑心脏停搏或血流动力学不稳定（推测心血管原因所致）的患者，在12导联心电图后应立即由经过训练的医生进行超声心动图检查并解析检查结果。

⚑如果初步评估提示主动脉夹层或肺栓塞，建议进行D-二聚体检测和多层螺旋CT血管造影（MDCTA）检查。

⚑诊断一栏中不同色块方框的宽度代表各种类型疾病在连续就诊的急诊急性胸痛患者中所占的比例

疑诊ACS患者的评估基于临床表现（症状、生命体征）、12导联ECG和心肌损伤标志物。

➤对有所疑诊和确诊ACS的患者，应进行短期和长期的危险评估，主要包括病史（心绞痛症状、体格检查、心电图、心肌损伤标志物等）。

➤10min内行心电图检查，必要时连续监测，最初可15～30min复查一次，观察有无动态演变。如果12导联心电图正常，可用18导联排除有无回旋支闭塞导致的V7～V9导联的变化。

➤所有患者须检测cTn：①如果使用hs-cTn检测，若首次结果阴性，则3h后复查；若2次检测值差异＞1ULN，可诊断ACS；②如果使用常规cTn检测，若首次结果阴性，则3h后复查；可每6～8h复查或持续监测直至正常，评估心肌坏死面积和动态演变过程。如患者就诊时间早（6h内），应同时考虑检测肌红蛋白。不建议再进行AST、ALT、LDH和CK等测定。

➤B型利钠肽（BNP）和氨基末端利钠肽原（NTproBNP）评估整体风险。

➤建议使用危险评分模型，如TIMI评分、GRACE评分和PURSUIT评分。

 

ACS鉴别诊断

目前有0/1h、0/2h、0/3h等多种基于hs-cTn的ACS鉴别诊断流程。

表1 急诊疑似ACS患者的生物标志物快速评估策略（流程）

⚑符合的人数是通过符合这种早期分诊策略的连续胸痛患者百分比来量化的：+，≈20%；++，≈40%；+++，≈50%～75%

⚑*，主要不良心脏事件（死亡，心梗，主要心律失常）

⚑ADP，加速诊断路径

⚑LOD，检测下限

2015 ESC NSTEMI管理指南推荐在ACS的诊断中使用0h/3h鉴别诊断流程和0h/1h鉴别诊断流程。0/1h流程对检测技术的要求较高，且判断标准需根据检测试剂厂家的不同而有区别，0/3h流程更适合基层医院。

应用这些鉴别诊断流程时，需注意：（1）肌钙蛋白检测需结合全面临床评估来使用，来确定那些可能不适合早期出院的高危患者；（2）这些策略应被视为分诊策略，而不是确诊策略，因为可能还需要冠脉造影、负荷测试、超声心动图或CT血管造影等才能确诊；（3）这些策略应该在最初的心电图排除STEMI后再应用，因为通过心电图可快速识别STEMI患者，不需要cTn检测即可立即进行再灌注治疗。

参考文献

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【3】Katrukha, AG et al.Degradation of cardiac troponin I: implication forreliable immunodetection. Clin. Chem. 1998, 44(12): 2433-2440.

【4】Zhang, J et al. Top-downquantitative proteomics identified phosphorylation ofcardiac troponin I as a candidate biomarker for chronic heart failure. J.Proteome Res. 2011, 10(9): 4054-4065.

【5】Katrukha, AG et al. Biochemicalfactors influencing measurement of cardiac troponin I in serum. Clin.Chem. Lab. Med. 1999, 37(11-12): 1091-1095.

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【7】Eriksson, S et al.Autoantibodies against cardiac troponins. N. Engl. J.Med. 2005, 352(1): 98-100.

【8】Eriksson, S et al. Negativeinterference in cardiac troponin I immunoassays bycirculating troponin autoantibodies. Clin. Chem. 2005, 51(5): 839-847.

【9】Rahman,A andBroadley,SA.Review article:Elevated troponin:diagnostic gold or fool’sgold?Emerg Med Australas.2014,26:125-130.

【10】Morton A.When lab testslie…heterophile antibodies.Aust Fam Physician 2014, 43, 391-393.

【11】Zaidi，A and Cowell，R.False positive cardiac troponinelevation due to heterophile antibodies more common than we recongnise.BMJ CaseReports，2010,Jul.

【12】Fleming，SM et al. False-positive cardiactroponin I in a routine clinical population.Am J Cardiol.2002,89,1212-1225.