骨形成蛋白联合雷奈酸锶对成骨细胞增殖和分化的影响

2023-05-10 14:56:27

文章来源:《中国骨质疏松杂志》2018年第2期

作者:陶周善1   周皖舒2*   江云云1   吴兴净1   张欣1   杨民1    谢加兵1    徐祝军1 

1.皖南医学院第一附属医院,弋矶山医院创伤骨科,芜湖 241000

2.皖南医学院第二附属医院老年病科,芜湖 241000

*通讯作者:周皖舒,E-mail: 1025066337@qq.com

       人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题,作为与其相关的疾病越来越引起世界的关注,骨质疏松就是其中最常见的一种。由于骨吸收的增加或骨形成的减少,导致骨质的连续损失和骨骼微结构的退化,甚至是最小的创伤就会导致骨骼脆性骨折。随着亚洲老龄人口的增加,该地区髋部骨折的发病率预计将从1990年到2050年增加到世界总量的1/4左右,因此,预防和治疗骨质疏松症是一项严重的挑战。但目前对骨质疏松症的治疗仍然不够有效,研究骨质疏松症治疗的组合治疗的评估是必要的。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)具有强大的诱导成骨能力,它能诱导骨髓间充质干细胞增殖并向成骨细胞方向分化,大量的研究已证实骨形成蛋白具有安全有效诱导骨形成的功效。雷奈酸锶(strontium ranelate,SR)是目前临床上所有抗骨质疏松药物中唯一一种兼具促进成骨和抑制破骨的药物,SR不仅可以通过促进成骨细胞增殖、分化来促进成骨,而且可以通过下调破骨细胞激活相关的一系列蛋白,从而起到抑制破骨的作用。有研究表明SR通过内源性BMP的上调表达促进成骨细胞分化。受这些研究的启发,笔者想进一步探讨是否通过外源性添加BMP来促进SR的作用。本研究目标是通过SR及BMP-2和成骨细胞的共培养来探讨两者联合使用的可行性,为临床上两种药物联合使用奠定理论基础。

材料和方法

1、细胞来源 

        取出生24 h的SD大乳鼠作为原代成骨细胞来源,由皖南医学院弋矶山医院中心实验室提供。

2、实验材料

        DMEM 培养基(GIBCO公司),胎牛血清、胰蛋白酶(HyClone公司);I 型胶原酶(Sigma公司);噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、TritonX-100(Sigma公司);SR(法国 Servier 公司),BMP-2(Peprotech,美国)。

3、成骨细胞传代培养  

        大鼠成骨细胞培养液使用DMEM,含有10%小牛血清,青霉素(100 U/mL),链霉素(100 U/mL),细胞培养在 37℃、含5%的二氧化碳培养箱中,待细胞生长覆盖瓶底 80%时进行传代。

4、BMP-2 及SR共培养对成骨细胞的影响

        采用MTT法检测成骨细胞增殖情况:实验分为4组:SR组、BMP-2组、SR-BMP组及对照组。用0.25%胰蛋白酶消化单层细胞,用含有10%FBS的DMEM 培养液配成单个细胞悬液,以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中,共4列,培养24 h。在倒置显微镜下观察,待大多数成骨细胞贴壁伸展后,弃去孔内液体,用无血清的DMEM冲洗数次,加1% FBS的DMEM 200 μL。一列孔加入5 mmol/L的SR(SR组),一列孔加入0.1 mg/L的BMP-2(BMP-2组),一列孔同样加入0.1 mg/L的BMP-2(SR-BMP组),一列孔为对照组(对照组),不加诱导液,3 d 换液1次,培养6 d换液后SR-BMP组的一列孔再次添加5 mmol/L的SR,继续培养到12 d。加入10% MTT 溶液(5 mg/mL)继续培养细胞 2 h,弃去细胞培养液,并加入DMSO(100μL/孔)轻微震荡,采用比色法通过酶标仪检测A 490 值。

        茜素红染色及碱性磷酸酶活性测定:待上述成骨细胞细胞培养12 d弃培养液,PBS漂洗2 遍,加入10% 福尔马林固定10 min。弃固定液,0.1%茜素红在37℃下染色5 min,流水冲洗,流水冲洗后换固定液,拍照记录结果。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性采用 PNPP法测定,细胞培养12 d弃培养液,PBS漂洗2遍,1%Triton X-100反复冻融3次,细胞裂解物孵育在磷酸盐底物中30 min,室温37℃,然后加入1 mol/L的NaOH终止反应,405 nm下测定吸光度值。根据蛋白质标准化的Sigma 校正曲线,计算酶活性。

        成骨细胞骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2表达检测:按上述方案培养到12 d,提取细胞总蛋白,加热变性后,于-20℃保存。取蛋白30 μL,进行 SDS-PAGE 凝胶电泳,将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜上,用封闭液封闭滤膜 4 h,依次结合相应浓度的抗OCN抗体,抗Runx2抗体和抗GAPDH抗体(1:1000),于4℃孵育过夜,洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/兔抗鼠(1:2000),孵育1 h。用化学发光法曝光胶片,冲洗显色,检测相应蛋白条带。用凝胶成像分析系统扫描分析蛋白条带。

5、统计学分析

        采用SPSS 19.0进行统计学分析,多组间细胞蛋白含量、ALP 定量及茜素红定量结果采用单因素方差分析(ANOVA),组间比较采用 LSD-t法;P<0.05 为差异有统计学意义。

结  果

1、茜素红染色及碱性磷酸酶活性

         经过BMP-2、SR以及BMP-2联合SR的处理,各组细胞茜素红染色及碱性磷酸酶染色的结果如图1A、1B所示,定量结果如图1D、1E所示,结果表明BMP-2、SR以及BMP-2联合SR处理的成骨细胞的矿化能力及活性明显增加,相对于对照组,实验组的成骨细胞矿化能力及ALP活性明显增加,和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),且以BMP-2联合SR处理细胞钙化能力最强及ALP活性最高,这表明BMP-2联合SR对成骨细胞矿化能力及活性影响明显优于单独使用的效果。

2、共培养对成骨细胞增殖的影响

        经过BMP-2、SR以及BMP-2联合SR的处理,MTT检测的结果如图1C所示,相对于对照组,实验组的成骨细胞数目明显增加,和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且以BMP-2联合SR处理细胞数目最多,这表明BMP-2联合SR对成骨细胞增殖影响明显优于单独使用的效果。

3、成骨细胞OCN及Runx2的表达

        经过BMP-2、SR以及BMP-2联合SR的处理,各组细胞OCN及Runx2蛋白表达的结果如图1F所示,定量结果如图1G、1H所示,结果表明BMP-2、SR以及BMP-2联合SR处理的成骨细胞的OCN及Runx2蛋白表达明显增加,相对于对照组,实验组的成骨细胞OCN及Runx2蛋白表达明显增加,和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且以BMP-2联合SR处理细胞OCN及Runx2蛋白表达量最多,这表明BMP-2联合SR对成骨细胞OCN及Runx2蛋白表达影响明显优于单独使用的效果。

讨   论

          本研究通过SR联合BMP-2使用来干预大鼠成骨细胞,观察对成骨细胞增殖、钙化能力及细胞活性和OCN及Runx2蛋白表达情况来研究联合使用的可行性,通过药物和成骨细胞共培养12 d,各组大鼠成骨细胞增殖情况、矿化能力及活性以OCN及Runx2蛋白表达情况被检测;结果表明相对SR及BMP-2单独使用的效果,联合使用的效果更佳,能极大提高成骨细胞增殖能力,增加成骨细胞的功能如矿化,同时明显增加OCN及Runx2蛋白的表达,这些结果表明SR联合BMP-2来干预大鼠成骨细胞有一定潜力,为临床上联合使用治疗骨质疏松症提供细胞学基础。

        骨骼在修复过程表现出一定的再生能力,以应对在骨骼发育或整个成年人连续骨骼重塑过程中发生损伤。骨再生包括一系列良好骨组织诱导和传导的生物过程,涉及许多细胞类型和细胞内和细胞外分子信号通路,通过确定的时间和空间序列,努力增强骨骼修复和恢复骨骼功能。骨形成取决于不同方面的共同影响,如:特异性细胞类型间充质干细胞和破骨细胞;骨基质(羟磷灰石、钙、细胞外基质分子等);可溶性分子(细胞因子、生长因子、激素、离子和维生素等)的表达和各种外界机械刺激。信号分子可以分为3类:促炎细胞因子、TGF-β超家族和其他生长因子和血管生成因子。白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在启动修复级联中起着至关重要的作用。细胞因子也调节软骨内骨形成和重塑。TNF-α促进骨髓间充质干细胞的募集,在软骨内骨化时引起肥厚软骨细胞凋亡,提供破骨细胞功能。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)超家族包括BMP、GDF,TGF促进骨折愈合期间各个阶段的内膜和软骨内骨骨化。BMP是骨形成和愈合中最重要的生长因子,BMP在骨髓间充质细胞、成骨细胞和软骨细胞的修复中产生,以触发一系列事件,这些事件支持骨和软骨的发育。骨质疏松症出现骨小梁的微型骨折,骨质疏松症治疗过程就是骨形成及骨折愈合的过程,BMP在此过程中发挥重要作用,局部添加BMP明显可以增加去卵巢大鼠骨密度,增加骨强度。

        近年来一种具有降低骨吸收和增加骨形成双重作用机制的抗骨质疏松药SR被开发出来,它可治疗绝经后骨质疏松症,使椎体和髋部骨折的危险性降低,使骨密度和强度得到增强,使其他药物单向作用的弊端得到克服。许多动物实验表明,SR可加快新骨的形成,同时减慢旧骨的重吸收。SR不仅可以抑制去势大鼠骨质的下降,还可以使正常动物的骨质得到增加,从而使骨质的耐受能力增加。同时它还可以在抑制破骨和刺激成骨的前提下增加骨质,加快健康小鼠骨形成,提高脊椎骨的骨质含量。由于刺激骨形成和抑制骨吸收的显著作用,锶(Sr2+)已被并入生物材料/支架中,以改善骨再生应用的生物活性。据报道,Sr 2+可能通过钙敏感受体依赖机制或调节Wnt/b-连环蛋白,促进成骨细胞分化,包括内源性BMP-2的上调和MAPK通路。本研究表明外源性添加BMP-2可以明显增加SR的功能,对成骨细胞的增殖分化和功能都有明显的促进效果。

         总的来说,虽然笔者没有实验不同药物剂量对实验结果的影响,但本实验目标已经达到,合适剂量的BMP-2和SR联合使用对成骨细胞增殖、分化及功能有叠加作用,明显优于单独使用的效果。


详见《中国骨质疏松杂志》2018年第2期文章,参考文献略。欢迎分享,原文转发应保留作者姓名,注明出处。其他微信公众号转载须经授权。

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