2018年3月23日凌晨，总统签署备忘录，依据“301调查”结果，将对从中国进口的商品大规模征收，并限制中国企业对美投资并购。宣布要对来自中国的约600亿美元产品征税。他安排多位高官到签字现场，并让记者到场见证他的又一个“历史时刻”。“中美”终于开打了。。中国也在随后宣布了反制措施，但对的“反击”却只有30亿美元。然而，在有些人嘴里，此事却越说越玄乎，给一些人的印象是所谓中美必形成两国激烈对抗的局面。
若真激烈对抗，便是“东风吹，战鼓擂，当今世界谁怕谁”了。
3月24日，多位朋友要老航评说此事。我的第一直感，是不可能有多大的事。因为真要打什么，其实不用打，与你切断贸易往来就是了。既然是贸易，就一定是双方的讨价还价，而不是什么战争。“”这个词本身是有问题的，可以说历史上并不真正存在。如果楞要说有，鸦片战争倒算一个。那情形就是一国或多国扛着枪炮来要挟你，要求你与他们做生意，并且还可能强买强卖。但鸦片战争那种胁迫式的贸易，已不是真正的贸易，而是强权交易了。那天就用心写了一篇文章，先回顾下历史，发现改革开放以来中美间的重大争拗事件，都是虎头蛇尾。再在此基础上就所谓的中美进行分析，就想提醒大家客观冷静地看待此事。但不知为何，此文在3月24日就是无法与朋友们见面，就只好再做删改，直到3月25日才发了出来。
从中美两国拟准备相互制裁的清单，也不难发现，所谓的纯属在打太极。美方拟制裁中国产品，除高铁外，都不是中国在竞争力强的科技类产品，且中国高铁进入市场，原来也不那么顺利，至今除了机车仍未拿到美方一项高铁合同。中方拟制裁的产品，不但总价值小，而且以农产品为主，多数也不是对中国市场有很大冲击力的东西，比如葡萄酒、花旗参之类的。
就在3月25日，财长姆努钦却突然表态了，他表示乐观认为，能和中国达成协议，从而避免对至少500亿美元的进口中国产品征收。这不就是“停战”的腔调吗？同时，。——说好的哪里去了呢？
美方的要求无非就是在知识产权保护、市场准入和美对中的外贸赤字等方面提出要求。客观地说，知识产权保护虽然中方依然存在不少的问题，但中方在改进，越来越多的人像老航一样，认识到知识产权保护不力，对本国科技进步、科技转化为生产力只有害处没有好处。市场准入的问题，大家如果还有点记忆，还能尊重点不久前发生的政事的话，就发觉中方已经随着自贸区的推进，已在同步去掉一些限制了。2018年3月5日，大领导就已经宣布全面放开一般制造业，扩大电信、医疗、教育、养老、新能源汽车等领域开放。并且有序开放银行卡清算等市场，放开外资保险经纪公司经营范围限制，放宽或取消银行、证券、基金管理、期货、金融资产管理公司等外资股比限制，统一中外资银行市场准入标准。美对中的外贸赤字，是容易解决的。就是中国增加对的产品购买。据传财长曾建议中国多买的天然气。英国《金融时报》2018年2月11日就曾报道，得克萨斯州切尼尔能源公司（Cheniere Energy）与中国石油天然气集团公司签署了一份为期25年的长期合同，每年销售至多120万吨液化天然气。——很明显，就算真有什么，美方对中国开打的理由并不充分。反过来，中国已经尝到国际自由贸易的甜头，不可能走闭关锁国的老路。
有人说，一定是中国做出重大让步了。贸易问题，向来是漫天要价，坐地还钱。让步是正常的，而且双方都会有让步，否则哪里谈得拢？对中国来说，换个角度看，所谓让步恰恰是在落实WTO的承诺，也就是继续改革开放，做正确的事，做利于国家长远发展的事。所谓让步，让那种原本对自己没有好处的短期利益或局部利益，不但该让，而且该主动让才对。
中国要发展，只能坚定继续改革开放，才有真正走向富强的可能。现代国家，都必须是开放的国家。只要有利于中国继续开放，中国也真在开放的路上奋力前行，其他的一些是是非非，在未来的某个时刻，就好解决了。看不到这一点，或者说看不到整体的大趋势，阁下真好意思说自己看得真吗？
既如此，同志为何要做出这么一出戏呢？别忘了他原本是商人，又曾是电视时代的红人，主持过一些电视节目。他就是一位表演艺术家，一方面是他偏好这个，另一方面确有为“”及中期选举做做表演秀之嫌。还有，近期也被又一轮性丑闻事件缠上了。多位女性指控过去与他有染并在2016年大选期间被迫封口。这事不仅是性问题，而且涉及诚信、胁迫、。也需要有事能帮助他摆脱这类纠缠。当然，虚晃一枪的所谓如此一闹腾，是可以促成中美间新贸易协议的签订。两国原来有些不清不楚的地方或根据新的形势需要重新定位的地方，通过新协议确定并落实下来，对双方都是有利的。
一些人基于自己的某些偏见偏识，见风就是雨，总习惯了打着鸡血般夸大事实，做出不符合实际的推论，这反而被某些愚蠢又固执极端派及臭名昭著的极端媒体用来攻击、讽刺、挖苦与嘲笑，同时也会让普通民众对某些人与某些群体心生反感与不信任感。所以，凡事真要从事物的基本事实与发展逻辑出发，不要想当然，尽说那些无聊的臆想的夸张的废话。有人嫌老航一直不温不火，说话不带煽动性。干嘛非要语不惊人誓不体呢？我知道鸡血派容易吸引眼球，可到头来，你做出的判断与事件的进程根本不符，有意思吗？看明白事，说明白话，做明白人，我以为比什么都好。过头话说多了，会把人说傻了的。
来源：人生茶馆
摘 要 生物监测是环境监测重要部分，当前我国环境监测主要依赖化学分析监测，近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制，我国生物监测发展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种，对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查，因此亟待发展我国水生实验生物，尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物，为加强其背景生物学研究，系统研究了河蚬生物标志物，最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。 主要研究内容与结果如下： 1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息，获得了28799934条高质量序列，鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高，而miR-10和Novel-2各自在鳃和内脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关，为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础。 2）采用RACE技术，成功克隆获得河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列， 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征，并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽显著调节，表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物，为环境污染物生物监测提供技术手段。 3）结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制，多指标结果表明长期低剂量暴露下，主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路，酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡。 关键词：河蚬，miRNA，有机磷酸酯，凋亡通路，生物标志物 ABSTRACT Biological monitoring is an important part of environmental monitoring. Currently the environmental monitoring in China mainly depended on the chemical analysis and monitoring. In recent years, although the internationally biological monitoring technology development is rapid, based on restrictions of our standard of environmental monitoring, the development of biological monitoring in our country has been in the research stage. Currently, biological monitoring manly relies on algae, Daphnia and fish aquatic species, for large benthic current monitoring depends only on biodiversity survey. Therefore, it is urgent to develop aquatic laboratory animals in our country, particularly to strengthen the screening of large benthic biomarkers and modeling study. Therefore in this study the widespread mollusk-Corbicula fluminea in our country was taken as an experimental organism, to strengthen the biological background research, we systematically study biomarkers of the Corbicula fluminea in monitoring environmental pollutants. Finally, we discuss mechanism of environmental pollutants on Corbicula fluminea through the above markers. The main research contents and results are as follows: 1) Through Illumina sequencing we obtained the Corbicula fluminea miRNA biological information, and obtained the 28799934 high quality sequences, then identified 45 conservative and 39 new Corbicula fluminea miRNAs; Fluorescence quantitative PCR results showed that nine miRNAs of 12 were expressed highest in the gastropod, while miR-10 and Novel-2 was expressed highest respectively in gill and visceral mass; Software prediction results showed that miRNAs related to environmental pollution genes, this provides a molecular biological basis for Corbicula fluminea as an experimental organism. 2) Through RACE technology, we successfully cloned the Corbicula fluminea the full-length cDNA sequence of CCK, Conopression and FFamide, predicted the molecular structure of Corbicula fluminea CCK, Conopression and FFamide protein, and analyzed the distribution of neuropeptide expression in different tissues of Corbicula fluminea; the organic phosphate significantly increased the expression of neuropeptide, indicating that the CCK, and Ffamide Conopression can be taken as Corbicula fluminea biomarkers and this provides a technical means for the biological monitoring of environmental pollutants. 3) By combining with transcriptome sequencing technology and fluorescence quantitative PCR we analysis the toxicological mechanism of typical organic phosphate(TDCPP and TBP), Multiple indicators showed that long-term low-dose exposure mainly effect apoptosis pathway, focal adhesion pathway, small cell lung cancer pathway and cell adhesion molecular pathways, the detect of caspase enzyme activity and apoptosis related genes confirmed that typical organic phosphate significantly induced Corbicula fluminea cell apoptosis. Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加，环境中的污染物越来越多，对人和动植物的健康造成了潜在威胁，大量研究表明，水体中的污染物随着营养能级的提高，难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]，而作为营养级最高的人类，自然会遭受很大的环境风险，而常规的化学法监测效率低，成本高，监测品种少，难以满足快速增长的污染物品种，因此使用生物作为监测工具，开发相关的生物标志物，对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量的环境污染物时，在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警，开发出相应生物标志物就能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况，比传统化学法更加具有优势。我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鲫的实时在线监测系统，目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况，为我们使用安全的饮用水提供了预警，运用了稀有鮈鲫对污染物的敏感特点。 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用，发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤，不是通过caspase途径，ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应，发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物，开发出了氟西汀的相关生物标志物，发现河蚬在氟西汀暴露下，ATP结合转运蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛酶活性升高，指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下，发现乙酰胆碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物，其活性在高浓度受到明显抑制。相比较而言，河蚬等底栖生物的研究比较少，相关研究也主要是常规标志物，但底栖生物能直接反应水体污染现状，开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价，监测上去具有十分重大的意义。 1.2 microRNA与生物标志物 1.2.1 microRNA背景介绍 MicroRNAs (miRNAs) 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸），通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]。自从第一个miRNA（lin-4）在线虫中发现以来[11]，大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]。目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]，人类中发现的miRNAs最多达到1881个前体[18]。在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]，此外，在珍珠贝中发现258个[19]，在牡蛎中发现199个[20]，然而淡水软体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道。 近期研究表明miRNAs与器官发育，细胞分化，细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外。37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且，厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候选的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能。尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能，但淡水软体动物的还不清楚。 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]，目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]。与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比，Solexa测序可以用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs，甚至在没有基因组数据的情况下[34]。 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相应的其靶基因表达也会发生改变。因此在环境毒理学研究中，miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物。王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露下，出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化，结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁，并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响，结果表明，72h氟虫腈暴露下，瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率，其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低。得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化，结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空白组分别显著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA没有观察到显著性变化，这个miRNA是与P53应答相关联。 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物，而水生动物特别是底栖动物没有相关研究，miRNA背景学资料相当缺乏，底栖生物能直接反应水体污染，其miRNA毒理学研究没有报道，急需进行相关研究。 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和，转录组对了解基因组的功能，揭露细胞和组织的分子成分，了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本，包括mRNAs，非编码RNAs和小RNAs；决定基因的起始位点，5’和3’转录结构，剪切类型，其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平。对于非模式生物，因为缺乏相关基因组信息，其遗传育种，生命特征等研究进展缓慢，传统的cDNA克隆，基因芯片技术耗时长，效率低，已经无法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展，第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具，与传统基因芯片，克隆技术相比，不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平，不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列，而且能检测稀有转录本和未知序列，提供丰富的转录组信息，为我们认识真核生物转录组信息提供了快速，高效，精确的测序技术。目前，已有人类细胞[38]，老鼠[39]，斑马鱼[40]，河蚬[41]，拟南芥[42]，啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析，为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 目前，二代测序平台主要有三个，如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX)，后来，单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术由Helicos Biosciences 公司推出。一个重要特点就是高通量，数以千万计的reads被测序。下表列举了这三个平台的异同点。 表1-1 几种测序平台优缺点 测序平台 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLX Helicos HeliScope 测序原理 可逆染料终 结合成测序 连接测序 焦磷酸合成 测序 单分子合成 测序 平均读长(bp) 100 35 400～700 21~35 运行时间(d/run) 3~10 7 0.5 5 美元/Mb碱基 0.05 0.15 15 1 主要错误类型 替换 替换 缺失与插入 缺失 准确率 ≧98.5% ≧99.94% ≧99.9% ≧99% 优点 性价比高 准确率最高 运行速度快，读长最长 产量高 缺点 读长短 运行时间长，读长短 错误率高，性价比低 错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例，转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复与加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析。流程图如下： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大，往往需要使用专业的生物信息学分析，对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后，将高质量的 reads 进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上，再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。一般主流的比对数据库有：国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI），欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute, EMBI），COG（Clusters of Orthologous Groups）蛋白数据库，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database）数据库。数据分析流程图如下： 图1-2 测序数据分析流程图 1.3.3 转录组测序技术在环境毒理学上的应用 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据，发现青鳉蛋白和脂肪代谢，线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果，鉴定了9383个差异转录本，发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代谢，类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之，转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势，不仅可以获取受试生物高通量生物学信息，还能鉴定差异转录本，深入研究环境污染物的毒性效应和机制。 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义，分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子，由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素，神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质，神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态，包括生长、代谢和繁殖[49]，例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现，首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来，并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年，大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来，如人，老鼠，猪和章鱼，这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中，许多神经肽也被发掘出来，有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]，而且目前还在不断扩充中，在功能上起到控制生殖，摄食，肌肉收缩，免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的，起到生理上控制鳃的作用[59]，而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]。在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下，牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61]。 肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62].在脊椎动物中，CCK广泛的分布于脑，据文献报道能减少鸟类，啮齿类动物，猪，羊，非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]。通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]。在软体动物在，CCK可能与一些综合感官功能有关，例如进食相关的行为，在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]。 Conopressin神经肽，首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]，随后在其他几个无脊椎动物中冶发现，例如牡蛎和蜗牛[56, 72]。文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关，在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74]，是Rfamide肽家族的一员 [57]，而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控，食物摄取，胃肠道和激素的调控，阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58, 75, 76]。而在软体动物中，文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide，并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77]。 1.4.1神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现，HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关。进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强，并随着时间推移越来越强[69]。MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理，发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高，但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响，总之，神经肽在环境毒理学上的应用也非常少，环境污染物对神经肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物（例如河蚬）的神经肽研究目前也没有报道，急需进行生物标志物的开发。 1.5 有机磷酸酯 1.5.1 有机磷酸酯介绍 自从一些溴代阻燃剂被禁用以来，有机磷酸酯(organophosphorus flame retardants，OPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性，产量大，具有可塑性，易生产，而被广泛的使用，如电子、装饰，化工，纺织等行业，因其是直接混入材料中，有机磷酸酯极易释放到外界环境中，从大气，水体，土地，生物体内都监测到有机磷酸酯的存在，而相关研究表明，有机磷酸酯性质稳定，难以降解，具有环境持久性，毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性，基因毒性和神经毒性，并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎，发现暴露引起了体重的减少，孵化率，存活率和心跳速率降低，增加了畸形率，进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平，而增加整体甲腺原氨酸水平，引起了甲状腺内分泌干扰效应。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11A，CYP17，GnRH基因表达量都发生改变，得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡，最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]，而在人居环境中大量存在有机磷酸酯，对人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 1.5.2 四种有机磷酸酯 磷酸三(2,3-二氯丙基)酯（tris(2,3-dichloropropyl) phosphate，TDCPP），使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂，据报道在TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]，环境中频繁的检测到了TDCPP的存在，如室内空气，灰尘，地表水，饮用水，河流，污水，沉积物和生物群体[88]。例如在地表水，报道TDCPP达到50 ng/L[89]，而更高浓度的TDCPP在德国和挪威的污水处理厂出水中监测到，从20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]。而在生物体中，发现TDCPP在鲈鱼体中达到36–140 g/kg脂肪重量[91]。在中国的松花江和太湖的沉积物中都检测到了TDCPP，浓度分分别是2.5-40 ng/L和0.62-5.54 g/kg[92, 93]。而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强，虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94]，而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯（Tributyl phosphate，TBP），广泛在核处理，化学工业，防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]，据报道引起了工人的恶心和头痛[97]，环境中广泛存在，甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内，发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一种典型的OPFRs，目前已经被列为痕量污染物名录[101]，在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成，纺织品背面涂层，PVC，纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000吨，但在1997年降至4000吨[101]。然而，TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]，目前在地表水，污水处理厂出水，海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性，致畸性，致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 2400-6100ng/L，每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程。目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea），一种双壳贝类，原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]，隶属软体动物门，瓣鳃纲（Lamellibranchis），真瓣鳃目（Eulamellibranchia），蚬科（Corbiculidae），蚬属（Corbicula）。是我国重要的淡水经济贝类之一，在20世纪初由移民传入欧洲和北美，由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖，且河蚬因其有双壳严密保护，环境适应能力极强，在当地的河流，湖泊，湿地大量繁殖，已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114]。 河蚬喜欢穴居，以水底泥，沙作为理想栖息环境，因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色，壳硬且厚，长约1.5～2.8cm，呈圆底三角形，壳顶部向外膨胀，壳面泛有紫色光泽，具有类似同心圆的生长轮脉，适宜生长水温为9-32℃[115]，以水中有机碎屑，浮游生物等为食，食性杂，通过鳃滤食食物[116]，是一种底栖生物，目前，在我国淮河，黄河，长江，江苏洪泽湖，洞庭湖等淡水水域，河蚬大量分布，在江浙，广东和福建等地，河蚬被大量养殖。河蚬不仅味道十分鲜美，营养价值很高，而且蚬肉可入药，能明目，通乳，利尿，开胃和解救，对心脏病，肝病，高血压具有显著效果[115, 117]，具有极高的经济价值和药用价值，在海内外特别是韩国日本市场很热销。 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中，活动能力缓慢，捕捞方便，接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用，是很理想的水体污染指示生物，一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]，目前以牡蛎，紫贻贝，菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]，而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少。河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛，当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究。 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类，是很好的环境毒理学指示性生物[123]。在我国淡水水域分布极为广泛，数量丰富，容易捕捞，与底泥长期直接接触，可以很直接的反应我国各水体污染状况，而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]。先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125]。 目前，国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应，Arini[126]等研究了河蚬暴露在Cd，Zn后的回复能力，结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出，而Zn很快就被净化掉。Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况，发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高。李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应，发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22，而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147。以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应。2）对水环境的实时生物监测，目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]，这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上，Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系，并在壳上安装电极来实时监测污染状况，Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系。3）水中污染物的毒理学研究，国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制，评价污染物有微囊藻毒素，有机污染物，内分泌干扰物，重金属，个人护理用品等[8, 9, 131-134]。陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制，发现5和50 μg/L卡马西平暴露后，河蚬Hsp22，Hsp27，Hsp40，Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调，而Hsp60基因表达受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应，结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调，而SOD，CAT，SeGPx和p-GST表达水平降低。 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据。 图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前，国内外已经研究神经肽30多年，在人，老鼠上研究的比较成熟，而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点，但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物，没有淡水双壳贝类的相关研究，且环境污染物对神经肽的研究报道非常少。近年来随着溴代阻燃剂的禁用，有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面，而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险，人们对OPFRs的关注度也越来越高，但是对OPFRs的毒理学研究还非常少，对OPFRs的危害评估体系尚不健全。急需建立生态安全评估体系。在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； ，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下： （1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA，2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃，5min，这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构，短暂离心，使溶液归于管底； （2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分： M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 1.25μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units 0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U 1μL 无核酸水 2μL Total volume 25μL 轻弹或短暂离心混合溶液。37℃孵育60min进行反转录反应，然后在-20℃保存。 3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech）合成 RACE 模板。 （1）Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm） 0.5μL dNTP Mix(20mm） 1.0μL Total volume 5.5μL （2）5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 5′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 8μL （3）3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL （4）（2）和（3）两离心管中的混合物分别混匀，短暂离心。 （5）72°C 下加热3min，然后42°C 下保温2min；在冰中冷却2min后 14000g离心10s。 （6）向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide，轻微振荡后短暂离心。 （7）室温下混合以下试剂： Buffer Mix 5.5μL RNase inhibitor 0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U） 2μL Total volume 8μL （8）向上述混合液中分别加入（6）中的 5′RACE cDNA 和（3）中 3′RACE cDNA，终体积为 20μL。 （9）轻微振动离心管瞬时离心，42°C孵化90min，之后于 72°C下保温 10min。 （10）加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释，cDNA库在-20°C可保存三个月，或在-80°C长期保存。 3.2.4河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因序列片段, 设计3'和5'RACE 特异性引物，引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件进行， 所设计的引物由上海生工生物公司合成（表4-1）。 表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’） Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGG qPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGT Universal primer CCK3F1 ATGCGTCCTCTTTTGTCAGC 3’RACE PCR CCK3F2 TCCTGGGATTATGATTACGG Conopressin3F1 GCTACCAACTGATTTCTCTATT Conopressin3F2 GGTCTAAATGGGCAGCCGTGTT FFamide3F1 CCTACGACGACGAAGAAAT FFamide3F2 AGAGCTATCTGGCGCTAGCAGA CCK5R1 AGGACGCATATTAACTTCTG 5’RACE PCR CCK5R2 AACTCGCGGTCATTTGCACT Conopressin5R1 TCCGGTCAGCAAAACAAAGT Conopressin5R2 GTCTTGGTATGCCTAGTATT FFamide5R1 TCACACATTTCTTCGTCGTC FFamide5R2 CTGTTCATGTTGGGGCTCAC CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的3'和5'引物(表 3-1）分别与通用引物UPM配对，利用SeqAmp™ DNA Polymerase进行3'端和5'端扩增。反应体系为： 3'或5' RACE cDNA库 2.5μL 10×UPM 5μL 3'或5' GSP(10μM） 1μL PCR-Grade Water 15.5μL 2×SeqAmp™ Buffer 25μL SeqAmp™ DNA Polymerase 1μL Total volume 50μL 将上述体系轻微振动混匀，瞬时离心，放入 PCR 仪中进行以下反应： 反应程序： 95°C 预变性 3min 95°C 30s 72°C 3min 循环 5 94°C 变性 30s 68°C 退火 30s 72°C 延伸 3min 循环 25 72°C 延伸 10min 4°C 保存 For ever 取 2μL 反应产物，在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行检测，恒定电压为 120V, 电泳时长为 30min。 3.2.4.2 PCR 产物的分离与回收 根据电泳结果，使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光，然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下。胶回收纯化过程基本操作如下： （1）将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中，每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2。 （2）于50°C加热5-10min，其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解。 （3）将上述溶化的凝胶液全部移入吸附柱，8000g离心30s，将收集管中的液体倒掉，吸附柱重新放回收集管中。 （4）向吸附柱中加入300μL Buffer B2，9,000g 离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 （5）向吸附柱中加入 500μL Wash Solution，9000g离心 30s，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 （6）重复步骤（5）一次。 （7）将空的吸附柱和收集管放入离心机中，9000g 离心 1min，室温下晾晒 5min。 （8）扔掉收集管，将吸附柱放到一个新的离心管中， 15μL Elution Buffer，室温放置 1~2min，9000g离心1min，收集 DNA 溶液， 该溶液可于-20°C 保存。 （9）将离心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中，重复步骤（8），以提高DNA的回收量。 （10）琼脂糖凝胶电泳检测回收情况。 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使用pMD20-T Vector（TaKaRa）试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接， 连接反应体系如下： pMD20-T 1μL 纯化的DNA片断 1μL 无核酸水 3μL Solution Ⅰ 5μL Total volume 10μL 16°C 反应30min。 质粒转化 （1）取 100 μL 感受态细胞（JM109）在冰水中融化。 （2） 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合，将混合物混匀，放置于冰上 30 min。 （3）在42°C水浴锅中热激45 s，立即放置于冰上冷却1min. （4）向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基，吹打混匀，37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min。 （5）室温下，4000rpm离心4min，将部分上清液吸出，剩下200μL 左右，吹打重新使细胞悬浮。 （6）将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加入到含有AMP的平板培养基上，涂布均匀，然后加入100 μL的菌液，用涂布环（事先用酒精灯烧，放皿内侧冷却）涂平板。 （7）在37°C 恒温培养箱中正向培养1个小时，之后倒置培养过夜（12-14h）。 筛选阳性克隆 （1）按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP，混匀，向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基，然后用无菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几次，放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h。 （2）选择M13引物对阳性克隆进行PCR筛选，PCR 反应体系如下： GoTaq® Green Master Mix, 2X 12.5μL 菌液 2μL M13-F（10 μM） 1μL M13-R（10 μM） 1μL 无核酸水 8.5μL Total volume 25μL 用移液枪轻轻吹打，使 PCR 管中样品混匀，用小离心机进行瞬时离心，使样品聚于管底，之后进行 PCR 扩增，反应参数如下： 95°C预变性 5min 95°C变性 30s 58°C退火 30s 72°C延伸 1min 循环数 30 72°C延伸 10min 4°C保存 For ever （3）取5μL PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选择目的条带清晰的菌液进行测序。 3.2.5 序列分析 使用Bioedit软件对测序结果进行载体序列去除和序列拼接，使用Expasy (http://www.expasy.org/)预测开放阅读框(ORF)并翻译成氨基酸。使用DNAMAN7对CCK, Conopressin和FFamide基因的氨基酸序列进行同源性分析，运用PrediSi (http://www.predisi.de/)对信号肽进行了预测。 3.2.6 CCK, Conopressin and FFamide在不同组织中的相对定量分析 根据河蚬β-actin基因和克隆所得的CCK, Conopressin and FFamide基因序列, 设计了定量PCR引物 (附录5)，进行相对基因表达量的检测。按照前述提取河蚬不同组织(包括内脏团、鳃、腹足和外套膜)的RNA并反转录合成cDNA。使用了Promega公司的Master Mix预混液，按照比例配置扩增体系。扩增体系总体积为20μL，其中PCR反应液包括10μL定量PCR Master Mix、0.4μL（200nM）正向引物、0.4μL（200nM）反向引物、2μL（100ng）cDNA模板，加无核酸水至20μL。PCR反应使用7500 Real-Time PCR system，程序为预变性95℃，5min；40个循环：95℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 30s；最后一个循环做出熔解曲线：95℃ 30s，57℃ 30 s，72℃ 60s，为了确定产物的唯一性和实验的有效性。每个样品三次重复。内参基因为β-actin[41]，目的基因的相对表达量根据2–ΔΔCt法计算[166]。实验的数据均通过SPSS 16.0进行数据分析。结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM），实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA，差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验，显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 3.2.7 4种有机磷酸酯暴露下CCK, Conopressin and FFamide基因表达变化 河蚬的暴露采用半静水法，暴露容器为圆柱形玻璃缸，暴露液溶剂为5L，亚慢性暴露时间为30d，暴露期间保持环境条件稳定，并喂食人工培养的绿藻或纱绢过滤的螺旋藻粉，具体暴露条件和规范见附录2。 毒性暴露时，选取体型大小相似、健康无伤的河蚬，平均体长15mm左右，随机放入各实验组，每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照，20μg/L，200μg/L，2000μg/L的TDCPP，TBP，TBEP和TCEP，每组三个平行。对处理完毕的不同浓度暴露后内脏团组织样品进行总RNA提取，并反转为cDNA，以β-actin基因作为参照基因，反应体系和程序如 3.1.5，检测不同浓度TDCPP，TBP，TBEP和TCEP对河蚬内脏团CCK, Conopressin and FFamide基因表达量的影响，数据处理及分析同3.2.5。 3.3结果与分析 3.3.1 河蚬CCK, Conopressin and FFamide基因的cDNA克隆与序列分析 将测序获得的cDNA序列进行拼接分别得到河蚬CCK，Conopressin和FFamide基因全长（图3-1）。全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp，其中5‘-UTR(非编码区)长分别为为413 bp，452 bp和85 bp，开放阅读框(ORF)长分别为522 bp，459 bp和273 bp，3’-UTR(非编码区)长分别为304 bp，441 bp和321 bp, 其中包括一个终止密码子，多聚腺苷酸加尾信号(Polyadenylation Signal Site)(AATAAA)和PolyA尾。 氨基酸序列分析表明，CCK神经肽由17个氨基酸组成，推导的分子量为19.18kDa。河蚬CCK神经肽与其他非脊椎动物多序列比较结果显示CCK氨基酸序列保守性低。例如与珍珠贝同源性为27.37%，与海蜗牛同源性为26.82%，与牡蛎同源性为22.35%。CCK的多重比对揭露了C末端的DYGLGGGRF在所选取的序列中完全保守（图3-2）。Blast和ClustalW分析显示Conopressin与大海鹿和海兔的同源性为42.20%，与牡蛎和珍珠贝的一致性分别为41.62%和38.15%。在这些物种中，N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的。推导的FFamide氨基酸序列通过BLAST and ClustalW分析得出与双壳贝类更加保守，例如珍珠贝（31.73%），牡蛎（29.81%），但在其他软体动物中保守性低一些，如耳鲍（27.88%），玄妙微鳍乌贼（24.04%）。在这五个物种中发现NSLFF为高度保守序列。 图3-1 CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因cDNA全长克隆序列和前体氨基酸序列 推导的氨基酸序列在核苷酸序列下方显示，推定的信号肽序列下面画黑色线，预测的神经肽成熟体标为红色并下划线，预测的运载蛋白标为紫色，基本剪切位点标为绿色，半胱氨酸残基蓝色，C末端酰胺化的甘氨酸标为橙色。 图3-2 河蚬CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因前体氨基酸序列与其他物种的多重比对。在所有物种都保守的残基全标黑，只有一个不保守的全标灰色。使用的其他序列来源如下： CCK: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold3913.1|size60815pfu); 牡蛎C. gigas (EST CU986686, EST CU993470); 海蜗牛A.californica (XP_005096263.1). Conopressin: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, pfudmixc42469g19050 IsotigID scaffold414176.1:1..292); 牡蛎C. gigas (EST AM854257.1(A)/FQ666404(C)); 海蜗牛A.californica (ACN24615.1); 静水椎实螺L. stagnalis(AAB35220.1);大海鹿A. kurodai(BAB40371.1). FFamide: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold38094.1);牡蛎C. gigas (CU987867); 耳鲍H. asinina (EST GD272468.1); 玄妙微鳍乌贼I. paradoxus (EST DB917831.1). 3.3.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布 利用荧光定量PCR分析了河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在不同组织中的表达水平，结果表明（图3-3），CCK基因在内脏团中表达量最高，接着是外套膜，鳃和腹足。而对于Conopressin，除了在内脏团中表达量最高外，在鳃，腹足和外套膜中表达量都比较低。而FFamide在腹足和外套膜中极少表达除了内脏团和鳃。 图3-3 CCK, Conopressin和FFamide神经肽在河蚬内脏团、鳃、腹足和外套膜中表达量 3.3.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达量在内脏团中的变化 使用荧光PCR 检测了20, 200和2000 μg/L浓度的TDCPP，TBP，TBEP和TCEP 30天暴露后河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide基因相对表达量的变化（图3-4）。结果表明，200和2000μg/L的TDCPP暴露组使CCK基因表达量与对照组相比上调了2.12和2.09倍，显著性提高，而20μg/L暴露组对CCK表达没明显影响。TBP暴露组随着浓度升高，CCK表达量逐渐提高（200μg/L，2.43倍；2000μg/L，4.37倍），20μg/L处理中无明显变化。TBEP的所有浓度暴露组与对照组相比都显著上调CCK表达水平，分别升高了2.48倍，3.34倍，3.09倍。而TCEP暴露组对CCK表达水平没明显影响。4种有机磷酸酯只有TCEP暴露组显著上调了Conopressin基因相对表达量（20μg/L，2.77倍；200μg/L，2.68倍；和2000 μg/L，3.19倍）。FFamide表达水平都受到了4种有机磷酸酯的显著性诱导（p<0.05，图3-4），其中都是200μg/L处理组上调最高，呈现倒U型。 图3-4 四种有机磷酸酯对CCK神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 图3-5 四种有机磷酸酯对Conopressin神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 图3-6四种有机磷酸酯对FFamide神经肽mRNA相对表达量的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 3.4结果讨论 3.4.1河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆及序列分析 目前对神经肽基因的研究主要集中于脊椎动物和海洋软体动物，双壳贝类特别是我国淡水双壳贝类神经肽研究仍是一片空白，本研究首次克隆河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因 , 这3个基因全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp，包括522 bp，459 bp和273 bp开放阅读框，分别编码173，152和90 个氨基酸，分析了这3个神经肽氨基酸序列的特征并用Blast和ClustalW与其他非脊椎软体动物进行了比对，发现CCK, Conopressin和FFamide神经肽的保守性在22.35%到42.20%之间，保守性较低，CCK具有DYGLGGGRF保守氨基酸，Conopressin神经肽N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的，发现NSLFFN是FFamide神经肽的高度保守序列。在脊椎动物中CCK涉及到胰腺液的分泌[167]，在非脊椎动物中CCK 在结构和功能上与胃泌激素有关，都是调控消化和进食[47]，CCK的生物活性肽区域(QGSWDYDYGLGGGRF-NH2 and AKSYGDYSLGGGRF-NH2)与其他非脊椎动物非常保守. 第一个确定的Conopressin神经肽在结构上与vasopressin相关，在杀手芋螺的毒液中发现[71]并且报道称在静水椎实螺中起到调控性行为的作用。在结构上，紧接着信号肽后面的是N末端Conopressin成熟体，序列是CFIRNCPPG-NH2，而毗邻C末端的神经垂体素包含14个半胱氨酸残基后面紧接着一个未剪切的和肽素同源区域。FFamide首先在静水椎实螺[168]，帽贝[169]和比萨茶蜗牛[169]中发现，在结构上与节肢动物SIFamide神经肽类似[170]。突出了典型的软体动物FFamide神经肽前体的结构特征，即包含一个信号肽，通过在二碱基位点剪切出的2个FFamide成熟体序列。据报道，FFamide与果蝇输精管精子运输有关并且调控性行为[171]。在河蚬中，2个推定的FFamide生物活性区域是DEGYSRLVQQKPLLFamide和GVSPNMNSLFFamide。 3.4.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布分析 河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在各组织中都有所表达，在脊椎动物中，CCK在脑中的表达非常丰富[47, 78]。在比萨茶蜗牛中，Conopressin很清楚的在胰腺，腹足肌肉，，卵精巢和和射囊中鉴定出来[56]。尽管之前的研究发现软体动物神经肽主要在中枢神经系统[47]或神经器官[172]表达，但河蚬非常小很难将神经系统从其他组织分离出来，并且还没有河蚬神经系统的报道。内脏团，鳃，腹足和外套膜经常被用来分析河蚬基因的组织分布[173-175]。从组织表达的结果来看，3个神经肽都在内脏团中表达量最高。内脏团是一个包括许多器官的混合组织，河蚬神经系统可能包含于其中。而其他3个组织是单一并明确的，有限或没有神经系统在这些组织，因此CCK，Conopressin和FFamide神经肽的表达水平与在内脏团中相比很低或几乎没有。 3.4.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达变化分析 河蚬因其广泛的地理分布，与底泥直接接触而作为一个很合适的淡水环境检测物种[132, 176]。在目前研究中，我们使用河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因表达的变化来评估TDCPP，TBP，TBEP和TCEP慢性暴露的影响。这四种典型的有机磷酸酯广泛的在阻燃剂和塑料工业中使用[88, 89, 177, 178]。目前还没有文献报道环境污染物暴露对脊椎和无脊椎动物CCK，Conopressin和FFamide表达的影响。文献报道了HgCl2比ZnCl2更能影响到gastrin/CCK8的行为和免疫反应[70]。 在我们的结果中200μg/L和2000μg/L TDCPP暴露下，CCK基因相对表达量显著上调，并且上调倍数一直，说明CCK表达对这两个浓度的TDCPP暴露敏感，而20μg/L TDCPP暴露组对CCK表达无明显效应，说明CCK表达对该浓度TDCPP不敏感。TBP对CCK表达呈现出剂量-效应关系，浓度越高，诱导效应越强，CCK表达可以很好的反应不同浓度TBP暴露的影响，表明CCK是TBP潜在的生物标志物，TBP被认为具有神经毒性[179]，而CCK是神经元细胞分泌的信号传递物质，可能TBP对河蚬神经系统有损伤并诱导了CCK的大量分泌。同样TBEP从低浓度到高浓度对CCK表达都有明显诱导效果，但文献关于TBEP的毒性报道十分有限，CCK对TBEP的敏感性比其他几个有机磷酸酯都要高，其具体影响机制还需要更深入的研究。不同浓度TCEP暴露对CCK表达水平没有明显影响，文献报道[108, 180]长时间的TCEP暴露后，大鼠大脑出现萎缩退化并有癌变效应，在这里CCK可能不是TCEP的作用靶点，CCK对TCEP也不敏感。 不同浓度的TDCPP，TBP和TBEP暴露对Conopressin表达没有明显效应，但TCEP的所有浓度都能引起Conopressin的显著性上调，结果表明Conopressin能很灵敏的指示TCEP的暴露影响，是TCEP的潜在生物标志物。 而FFamide神经肽基因相对表达量对不同浓度的4种OPFRs都呈现出倒U型，都是显著性上调，在20μg/L和200μg/L浓度下，随着浓度升高，FFamide相对于对照组表达量也越高，但在2000μg/L浓度下效应下降，可能是FFamide神经肽表达很容易受到有机磷酸酯的影响，在高浓度超过了分泌FFamide神经元细胞的能力，反而不如200μg/L处理组诱导效应高。之前有文献报道河蚬经常在3.13 mg/L 毒死蜱暴露下关闭双壳[9]. 河蚬闭壳的现象也曾在水中金属暴露下有过报道[181]。高浓度OPFRs暴露下河蚬可能通过闭壳来保护自身。四种OPFRs都对FFamide产生类似效应更加印证了，FFamide能很好的标志OPFRs的影响。 3.5 本章小结 本章通过RACE技术克隆了CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因的全长序列，运用生物信息学软件分析了这些全长序列，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。主要结论如下： 1、CCK, Conopressin和FFamide神经肽具有典型的软体动物神经肽特征，在不同组织的表达情况反映了神经细胞的分布。 2、TDCPP、TBP和TBEP对CCK神经肽基因都有不同程度上调影响，CCK基因可作为这3种有机磷酸酯的潜在标志物。仅有TCEP对Conopressin有显著诱导作用，而对CCK没有明显效应，可作为区别TCEP与其他污染物的标志物。4种OPFRs对FFamide都有显著效应，呈倒U型，表明FFamide能很灵敏的应答这4种标志物，高浓度的暴露效应下降，可能是降低了河蚬的健康水平，使其机能下降。 第四章 有机磷酸酯TDCPP和TBP对河蚬毒性效应与作用机制研究 4.1 引言 目前，有机磷酸酯阻燃剂在生活生产中大量使用，而其对人和动物的毒理学效应还不是很清楚，本研究使用RNA-seq技术探究了TDCPP和TBP暴露后，河蚬转录组数据的变化，并对河蚬行为学指标，基因表达变化和酶活性进行了验证。 4.2 材料与方法 4.2.1 实验材料 磷酸三（1,3-二氯异丙基）酯（TDCPP，CAS:13674-87-8；纯度﹥98%）； 中性红溶液（浓度为1 mg/L）； 磷酸三丁酯（TBP，CAS:126-73-8；纯度﹥98%）； 其中，由于有机磷酸酯不溶于水，将2种有机磷酸酯溶于丙酮并储存于棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中备用；中性红现配现用。 4.2.2 毒性暴露实验 暴露实验详见附录4。毒性暴露时，选取体型大小相近、健康无伤的河蚬，平均体长20.47±2.15mm左右，随机放入各实验组，每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照，20μg/L，200μg/L，2000μg/L，每组三个平行。暴露阶段结束后采集河蚬的内脏团组织并提取蛋白和RNA于-80℃保存。 4.2.3 河蚬行为学指标测试 参照国内外文献中贝类行为学研究的方法，建立了能够应用到水生态毒理学中的河蚬行为学指标——虹吸作用的测试方法。 方法如下：河蚬生活在水底，靠进水管和出水管过滤水中的食物为生，国外很早就有研究，利用河蚬的虹吸作用指标来监测水体中的环境污染物。本方法主要基于Cooper和 Bidwell（1996）的方法，在其方法的基础上进一步改进。暴露实验结束后，分别取空白组和暴露组各个组河蚬5只，立即放入盛有100mL中性红溶液（浓度为1mg/L）的烧杯中，使用分光光度计测定此时在530nm处的吸光值；2h以后再测定吸光值，根据以下公式计算河蚬的虹吸效率m（mL/animal/h）。 公式： ，（4-1） 注：M为测试溶液的体积，n是河蚬的数目，t为测试时间，c0 为开始测试时溶液的吸光值，ct为测试结束时溶液的吸光值。 4.2.4 河蚬生化指标测试 河蚬的生化测试指标包括河蚬内脏团组织中Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性。在测定之前，需要提取河蚬各个组织的蛋白，具体操作流程和步骤如下： 4.2.4.1蛋白提取 河蚬蛋白提取的方法，具体步骤如下： （1）取50-100mg内脏团组织于1.5mL EP管中，加入200μL裂解液I（30 mM Tris，2M硫脲，1% w/v DTT，7M尿素， 4% w/v CHAPS，蛋白酶抑制剂），置于冰上，用电动研磨器研磨充分。 （2）在研磨后的溶液中补充加入400μL裂解液I，混匀后置于冰上，间隔超声，功率80-100W，超声5s，冷却10s，共进行10个循环。 （3）4℃，12000×g离心10 min，取上清，避开上层油脂。 （4）每份样品取3μL用于蛋白定量，定量步骤按2-D Quantity kit（GE Health）试剂盒说明进行。 （5）根据测得的蛋白浓度，将每份样品用裂解液稀释到3mg/mL。放于-80℃中备用。 4.2.4.2 Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9酶活性测定 本实验测定了河蚬内脏团Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的酶活性，均采用购自碧云天生物技术研究所（中国江苏）的相应试剂盒按照说明步骤进行测定，具体方法如下： Caspase 3酶活性的检测： 1. 准备工作： a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 2. 测定pNA标准曲线： a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。 b. 将试剂盒中的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。 c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，测定A405。 d. 用每一个标准品的A405减去空白对照的A405计算出吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。 3. Caspase 3酶活性的检测： 将试剂盒中的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰上融化。 如下设置反应体系： 空白对照 样品 检测缓冲液 40μL 40μL 待测样品 0μL 50μL 裂解液 50μL 0μL Ac-DEVD-pNA (2mM) 10μL 10μL 总体积 100μL 100μL c. 加完试剂后，将混合液在37ºC保温60分钟。测定样品的A405。 d. 将样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中Caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的计算就可以产生了多少量的pNA。 Caspase 8酶活性的检测： 试剂采用Caspase 8试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 Caspase 9酶活性的检测： 试剂采用Caspase 9试剂盒，其他反应体系和步骤同Caspase 3 4.2.5 文库构建与测序 4.2.5.1 总RNA提取与质量鉴定 暴露实验结束后，分别提取空白对照组和2000μg/L TDCPP和2000μg/L TBP暴露组河蚬内脏团组织总RNA，为了获取尽可能多的转录本信息，我们采用混合样的方法，取样之前，停止喂食一个星期，取壳长20.47±2.36mm的成年河蚬5只，分别提取内脏团、鳃、腹足和外套膜等组织，进行总RNA提取，对总RNA纯化和鉴定后等比例混合。提取采用Trizol法。使用QUBIT2.0光度仪和安捷伦Agilent 2100 Bioanalyzer 进行RNA浓度和质量测定，将RIN≧8且260/280nm光度比值≧1.8的RNA进行下一步建库和上机测序。 4.2.5.2 建库与测序 (1) mRNA纯化与片段化。取4μg总RNA建库，用带有 Oligod(T)的 Beads 对 Total RNA 中 mRNA 进行纯化，然后选择合适程序对mRNA进行片段化； (2) cDNA合成与末端修复。使用Second Strand Synthesis Enzyme Mix和合适程序进行cDNA合成，并在3’端加A； (3) PCR扩增与产物富集。使用合适程序进行PCR使文库产物富集，将产物电泳后切胶纯化。 (4) 文库质控。使用 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 判断 PCR切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求； (5) 混合文库。根据文库的定量及定性结果将每个 library 的摩尔浓度统一调整到 2nM，然后根据实验设计选择性的将需要混合的 library 进行等量等浓度混合，保证混合后的 library 的终浓度也是 2nM，体积大于等于 10 µL ，然后将文库进行-80℃保存。 (6) 上机测序。使用Illumina平台进行双向测序，得到测序数据。 4.2.6 转录本生物信息学分析 对测序得到的原始 reads（双端序列）进行过滤后，将高质量的 reads进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上，再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。 4.2.6.1测序数据过滤及统计 对原始数据进行过滤，使用 ngsQCToolkit-2.3.3 2 软件过滤掉低质量 reads 和有引物污染的 reads。 4.2.6.2 转录本组装 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行组装，Trinity 利用 de Bruijn graph path 算法对 reads进行 denovo 拼接。得到组装后的 Unigene Library（Trinity.fasta），过滤掉外显子总长低于 200bp 的转录本后，得到一个最终的转录本序列文件。 4.2.6.3功能注释 使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt，Nr，GO，KEGG，Swiss-Port)进行比对；利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测；signalP 8 进行信号蛋白预测；tmHMM 进行跨膜区域预测，最后利用Trinotate 整合注释结果。 4.2.6.4表达量分析 在 RNA-seq 分析中，我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序片段（Fragment，一条 fragment 指一对 reads 所在的序列片段）计数来估计基因的表达水平。Fragment 计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度、测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，引入 FPKM 9 的概念，FPKM （Fragments Per Kilo bases per Million fragmentss）是每百万测序片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目。FPKM 同时考虑了测序深度和基因长度对 reads 计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法。 ???? = (Total exon fragments)/(mapped reads(Millions)×exonlength(KB) )(公式4-2) 我们使用 RSEM 软件进行表达量分析。 4.2.6.5 差异表达基因分析 使用 edgeR 10 找出不同样本间存在差异表达的转录本。挑选|log 2 FC|>=1 并且p value<=0.001 2="" log="" fc="">=1 即为TDCPP和TBP暴露组上调基因，log 2 FC<=-1 为TDCPP和TBP暴露组下调基因。 4.2.6.6差异表达基因GO注释和KEGG富集 根据实验目的筛选差异基因后，我们对差异转录本进行了GO 注释和KEGG富集分析，研究差异转录本形成的KEGG信号通路 4.2.7 基因定量验证 使用河蚬β-actin基因作为内参基因，本实验首先对河蚬凋亡系统相关基因进行了基因定量验证，定量PCR引物见附录5。 4.2.8数据处理与分析 结果均表示为平均值±标准误差（means±SEM），实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA，差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验，显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 4.3结果与分析 4.3.1 虹吸行为指标测试 30d的暴露实验期间，河蚬死亡率小于3%，且各实验组间死亡率没显著差异。对河蚬的虹吸行为测试结果表明（图4-3，4-4）：随着TDCPP和TBP暴露浓度的升高，河蚬虹吸速率逐渐下降。 图4-3 TDCPP对河蚬虹吸效率的影响 注：河蚬虹吸效率（Filtration rate）的单位为mL/animal/h，即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM（n=5）表示。 图4-4 TBP对河蚬虹吸效率的影响 注：河蚬虹吸效率（Filtration rate）的单位为mL/animal/h，即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM（n=5）表示。 4.3.2 凋亡相关酶活力测试 根据转录组测序结果，为了进一步探究TDCPP和TBP对河蚬主要毒理机制，暴露实验结束后，提取了河蚬内脏团蛋白样进行Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9的酶活性测试。结果见图4-5。其中TDCPP对Caspase 3和Caspase 8活性都有显著性诱导，而只有200μg/L和2000μg/L TBP对Caspase 3和Caspase 8活性有显著诱导。另外TDCPP和TBP对Caspase 9的有上调趋势，但不明显。 图4-5 TDCPP和TBP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9活性的影响 注：数据均使用 mean±SEM（n=3）表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验，显著性水平为 p < 0.05，* 表示具有显著性差异。 4.3.3 转录组差异表达分析 4.3.3.1 Illumina测序与序列组装 提取空白组，TDCPP和TBP暴露组河蚬内脏团组织进行建库、测序，去除低质量的reads，所有样品过滤前后数据量及质量值统计情况如下表4-2所示： 表4-2 样品过滤前后数据量及质量值统计 Sample Raw Reads Number Raw Bases Clean Reads Number Clean Bases Clean Rate(%) Q20(%) Q30(%) CK 61193398 7710368148 58779228 7406182728 96.06 97.38 94.46 TDCPP 49179514 6196618764 47531434 5988960684 96.65 97.97 95.58 TBP 48210200 6074485200 46529664 5862737664 96.52 97.81 95.27 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行De novo组装，对 Trinity.fasta 进行统计分析得到如下内容： 图4-6 河蚬转录本序列长度分布与所占百分比 4.3.3.2 转录本的比对与注释 本实验使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt，Nr，GO，KEGG，Swiss-Port)进行比对，利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测；signalP 8 进行信号蛋白预测；tmHMM 进行跨膜区域预测，最后利用Trinotate 整合注释结果。具体结果见图4-3。 表4-3 注释整合结果 数据库 转录本数 注释率% 总转录本 160698 100 Nt 18271 11.4% Nr 17476 10.9% KEGG 8942 5.6% Swiss-Port 23940 14.9% GO 3722 2.3% Pfam 9999 6.2% signalP 9999 6.2% TMhmm 6802 4.2% 4.3.3.3 转录本的鉴定与富集分析 首先使用FRKM方法对转录组的表达水平进行标准化，然后对TDCPP，TBP暴露组与空白对照组鉴定出差异转录本（Differentially expressed transcripts，DETs）。结果显示TDCPP暴露后表达水平有差异的转录本DETs合计8160个（p<0.001，图），其中4037个DETs显著性上调（与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），4123个DETs显著性下调（与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），而TBP暴露后表达水平有差异的转录本合计8207个（p<0.001，图），其中4162个DETS显著上调与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），4045个DETs显著下调与对照组相比，表达水平倍数大于等于2），根据KEGG数据库注释结果，富集出了TDCPP和TBP分别对河蚬的主要作用通路，这里选取前十名的通路列表。 347个DETs注释到了KEGG信号通路，其中TDCPP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而共有369个DETs注释到了KEGG信号通路，其中TBP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。 表4-4 TDCPP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 Apoptosis 49 ko04510 Focal adhesion 56 ko05222 Small cell lung cancer 40 ko05145 Toxoplasmosis 45 ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 24 ko04064 NF-kappa B signaling pathway 33 ko04640 Hematopoietic cell lineage 15 ko05164 Influenza A 33 ko05134 Legionellosis 24 ko04668 TNF signaling pathway 28 表4-5 TBP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 Apoptosis 58 ko04970 Salivary secretion 46 ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 32 ko05145 Toxoplasmosis 53 ko04640 Hematopoietic cell lineage 21 ko04064 NF-kappa B signaling pathway 40 ko05222 Small cell lung cancer 44 ko04662 B cell receptor signaling pathway 21 ko04911 Insulin secretion 20 ko05164 Influenza A 34 4.3.3.4 TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路作用机制分析 结合KEGG通路情况，分析了TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路的影响。TDCPP和TBP都对河蚬凋亡通路产生了影响。TDCPP和TBP作为凋亡刺激源，激活河蚬凋亡通路，分为两种途径（图4-7），1）线粒体途径，诱导线粒体中细胞色素C上调释放，自由的细胞色素C使Apaf-1与Caspase 9结合体瓦解，Caspase 9自由体将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体，导致了细胞的凋亡；2）TDCPP和TBP结合到细胞膜的死亡配体结合位点，进而使Caspase 8从结合体上释放，将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体，导致了细胞的凋亡。 图4-7 凋亡通路示意图 4.3.4 凋亡相关基因的验证 暴露实验结束后，使用荧光定量PCR检测了河蚬内脏团中凋亡相关基因（Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C）的表达变化，结果表明（图4-8,4-9），随着你的的升高，TDCPP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因都有上调趋势，其中200μg/L和2000μg/L的TDCPP暴露组显著上调；而TBP随着浓度升高对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因表达诱导也逐渐增强，但除了2000μg/L的TBP暴露组对Caspase 9表达有显著之外，其他浓度的TBP暴露组对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因上调影响都不超过2倍。 图4-8 不同浓度TDCPP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因相对表达量的影响 图4-9不同浓度TBP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因相对表达量的影响 4.4 讨论 4.4.1 TDCPP和TBP对河蚬的毒性效应 河蚬是淡水底栖生物，直接接触底泥，靠滤食水中有机碎片进食，活动行为少，能直接反映生活水体的长期污染情况，是生物监测的优势物种[132]。目前双壳贝类等虹吸速率已经被用作是水污染持续性监测的一个行为学指标[182]，在30天不同浓度TDCPP和TBP暴露暴露后，河蚬虹吸速率随着暴露浓度升高而逐渐下降。Moulton[183]等报道了96 h氨基甲酸酯类农药暴露后，贻贝和河蚬胆酰酯酶活性受到抑制，虹吸速率下降，生命状态下降，虹吸行为是一个指示生命活性的有效指标。另外，研究证实了多种污染物都可以导致双壳贝类等虹吸速率下降[130, 184]。Liao[181]等研究了段时间内水中不同浓度Cu和Cd对河蚬双壳的张闭速率的剂量效应关系，并成功的建立了河蚬生物评估模型。Cooper[9]等报道了3.13mg/L的毒死蜱暴露后，河蚬的双壳一直都关闭，虹吸速率受到显著抑制，更高浓度下，河蚬已经没有虹吸速率的数据。总之，河蚬速率能有效的反应河蚬的生命状态，不同浓度TDCPP和TBP暴露下，河蚬活力下降，表明了污染物对河蚬造成了影响。 4.4.2 TDCPP和TBP对河蚬的作用机制研究 为了深入探究TDCPP和TBP对河蚬的毒理作用机制，我们使用2000μg/L TDCPP和TBP对河蚬进行了30天的暴露，然后提取了这两个暴露组和对照组河蚬的内脏团进行RNA-Seq测序。目前，包括河蚬在内的多种生物已经成功运用RNA-Seq技术进行了毒理学机制研究[41, 185-187]，是一种精确，可靠，实用的毒理学研究方法[188]。在本实验中，我们分析了一个对照组加两个暴露组的转录本数据，鉴定出大量差异转录本，并依据主要影响通路，验证了生化指标和基因表达结果，更加印证了转录组得出的毒理机制结果。 对KEGG结果分析后，我们发现TDCPP暴露主要激活了河蚬凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而TBP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。凋亡通路是TDCPP和TBP对河蚬的主要影响通路，Na Ta[189]等报道了TDCPP暴露引起了PC12细胞的凋亡数量上升。Chen[190]等研究发现TDCPP能引起斑马鱼胚胎的凋亡现象。目前，国内外对TBP的毒理学研究很少，所以我们重点围绕凋亡通路进行了研究。细胞凋亡一般有两种途径：线粒体途径和外源途径。我们分析了KEGG中差异转录本后发现Caspase 3, Caspase 8, Caspase 9以及Cytochrome C基因上调达到2倍。刘晓婷[191]等介绍了线粒体凋亡途径中细胞色素C释放结合凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1）激活Caspase 9，进而激活Caspase 3导致细胞的凋亡。Abhari1[192]等报道了相关死亡结构域蛋白（Fas-aasociated death domain ，FADD）凋亡途径途径，外源凋亡因子通过FADD与Fas胞浆区呈特异性结合，将信号传导到细胞内，使Caspase 8激活，并进一步激活Caspase 3，从而引起细胞的凋亡。通常，正常细胞中的 Caspase 均以无活性，并以酶原形式（pro-Caspase)存在，而外源凋亡诱导信号刺激细胞后，天冬氨酸残基位点的蛋白水解而激活，引起 Caspase 级联反应，导致细胞凋亡发生。我们使用凋亡试剂盒测定了Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9的酶活性，发现所有TDCPP暴露组对Caspase 3和Caspase 8活性有显著性诱导作用，在高浓度与相关基因的验证结果一直，而对Caspase 9酶活只有升高趋势，没有达到显著性诱导，Caspase 9是线粒体途径关键酶，说明TDCPP介导的凋亡以外源凋亡途径为主。同样只有200μg/L和2000μg/L 的TBP暴露组对Caspase 3和Caspase 8酶活产生了显著性上调，对caspae 9作用不明显，相对应当基因验证结果只有上调趋势，除了2000μg/L暴露组对Caspase 9诱导效应明显，其他组对包括细胞色素c在内的凋亡相关基因都没有起到显著性影响。相反200μg/L和2000μg/L 的TDCPP暴露组对Caspase 9和细胞色素c都产生了现在性诱导，结合酶活结果，说明TDCPP对河蚬的凋亡效应比TBP要强。总之，实验结果验证了RNA-Seq差异转录本分析出的凋亡通路结果。 4.5 本章小结 本章通过对TDCPP和TBP暴露后河蚬虹吸行为测试与RNA-Seq表达谱研究，研究了TDCPP和TBP对河蚬的毒理学机制。得出以下结论： 1、低浓度和高浓度的TDCPP和TBP均能引起河蚬虹吸率的下降，对河蚬造成健康状况的影响； 2、RNA-Seq分析结果表明，TDCPP和TBP暴露产生了大量差异转录本，成功运用到毒理学机制研究中。 3、TDCPP暴露主要激活了河蚬凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而TBP暴露对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。 4、通过河蚬生化指标和基因指标验证，TDCPP和TBP暴露对造成了河蚬内脏团细胞的凋亡效应，主要通过外源凋亡途径，TDCPP比TBP对河蚬细胞的凋亡作用要强。 第五章 总结与展望 本研究以我国淡水双壳物种河蚬为实验生物，通过Selox测序获取并鉴定了河蚬保守和新miRNAs，预测了miRNA与4个环境相关基因的关系，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。填补了河蚬miRNA生物信息的不足。运用RNA-Seq表达谱技术分析了TDCPP和TBP暴露后河蚬的差异转录本，重点分析凋亡通路，并验证了生化和基因指标，与RNA-Seq结论一致，并且主要是通过外源凋亡途径，还分析得出TDCPP比TBP对河蚬的凋亡效应强。成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽cDNA全长基因，并对它们的氨基酸序列进行了同源性比对和分析，开发并初步应用了河蚬神经肽标志物，评估了四种有机磷酸酯的毒性效应，对应用这些标志物完成了实验论证。 目前，我国水体污染的生态毒理学研究还处在发展阶段，大量的化学品与相关标志物的筛查还需要进一步研究，以河蚬为受试生物并结合RNA-Seq开发生物标志物的方法能很好的评估化学品的毒性效应与机制，但是还需要完善几个方面： 1、河蚬生物信息学比较缺乏，亟待开发出完整的生物信息学背景； 2、神经肽标志物的开发还处于起步阶段，完善的标志物评估体系需要进一步建立起来； 3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象，以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法。
Copyright © 2023 All Rights Reserved 版权所有 福建水产设备联盟