溴甲酚紫法测定血清白蛋白

长期以来，溴甲酚绿(bromcresol green，BCG)染料结合法测定血清白蛋白(Albumin，ALB)广泛应用于临床，国内大多数医院目前仍然沿用这一方法，。近年有外国公司推出了溴甲酚紫(bromcresol purple， BCP)法测定血清白蛋白的商品化试剂，国内已经有部分医院引入相应的仪器和试剂并逐年增多，但对BCP测定白蛋白的结果却未见完整评价。在临床实际工作中，用这两种方法测定血清白蛋白的结果可有较大差异，对一些需要对白蛋白准确定量的病人的诊治造成一定的困扰。本试验特对BCP测定白蛋白的方法作一评价，并对其与传统BCG法的差异作一比较。

1材料和方法
1.1仪器与试剂 DADE BEHRING Dimension RXL型与Dimension RXL专用密闭ALB试剂(批号EJ2235)；OLYMPUS AU800型全自动生化分析仪、日本WAKO ALB试剂(批号DJ326)。ALB标准品 采用Dimension TP/ALB Calibrator(批号1GD024)和Olympus System Calibrator(批号105E)；质控品采用美国DADE Moni-Trol Chemistry Control(批号EM2-0312)。
1.2原理 在pH4.9醋酸盐缓冲液中，溴甲酚紫与白蛋白结合形成绿色复合物，在600nm波长处的吸光度与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可计算样品血清中的白蛋白浓度。
1.3方法 取Dimension TP/ALB Calibrator的中间水平42g/L作标准，以两管去离子水作为0 g/L的标准对RXL进行假三点定标，随后测定83 g/L、72.63 g/L、62.25g/L、55.33g/L、42g/L 28g/L、21g/L、14g/L、10.5g/L、5.0g/L共十个浓度的ALB标准溶液及其吸光度，制作标准曲线；收集30ml新鲜混合血清用Dimension RXL进行批内和批间精密度试验。另收集100份门诊就诊者血清，用System Calibrator对AU800的ALB进行定标后，两台生化分析仪同时进行ALB检测。
2结果
2.1标准曲线 用RXL全自动生化分析仪检测上述十个不同浓度的ALB标准液的吸光度，以ALB浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制校正曲线。结果表明ALB浓度在5.0~83g/L之间，线性关系良好，相关系数为1.000，回归方程式：y=0.234X-11.588。
2.2精密度 收集30ml新鲜混合血清(无明显溶血、脂血、黄疸者)，分成60份，取30份上RXL连续分析，求得 =42.76g/L，SD=0.418，批内变异系数为0.95%；另30份混合血清样品置-20℃冰箱冷冻保存，每日早晚各测定一次，共计15d ，测得其 =41.92g/L，SD=1.27，批间变异系数为3.03%。
2.3回收率 取一份新鲜血清分装为4管，每管900μl，RXL测定其中1管ALB浓度为39.70g/L，另3管分别加入14g/L、42g/L、83g/L的ALB标准液100μl，测得回收浓度分别为1.36 g/L、4.30 g/L和8.20 g/L，回收率分别为97.1%、102.4%和98.8%，平均回收率为99.4%。
2.4干扰试验 取一份新鲜血清，测定其ALB为41.2g/L。将胆红素纯品配成378μmol/L的溶液，将血清样品与胆红素溶液按9:1、2:1、1:1、1:2的比例进行混合，然后测定ALB含量。结果表明，252μmol/L的胆红素对BCP法测定ALB无影响。血清样品与20%的Trilitid按6:1、4:1、3:1混合，结果显示，Trilitid浓度为2.9%和4.0%时对测定结果无明显影响，浓度达5%时会产生7.76%的正干扰。溶血标本血红蛋白≤4.0g/L时对测定无明显干扰。
2.5显色稳定性 ALB可与BCP进行即时完全反应，不受时间和温度变化的影响，反应后吸光度可稳定1h以上。
2.6方法对比试验 用本法(X)和BCG法(Y)分别测定100份门诊就诊者血清ALB，经统计处理，其回归方程为y=1.08x+5.98，r=0.929，经SPSS软件统计其F=364.84，P<0.001，两种方法测定结果显著相关。将两种方法测定100份样品的结果进行配对t检验，t=38.29，P<0.001，两种方法测定的结果有显著性差异。但将BCP法的测定结果经回归方程换算后，两法结果非常接近。
2.7正常参考值 用BCP法测定120名健康成人血清ALB含量，其中男性65例，女性55例，年龄18~50岁，结果( ±s)为(41.5±3.75)g/L，参考值范围( ±2s)：34~49g/L。与国外人群的参考值范围35~50g/L相近。
3讨论
传统的溴甲酚绿法测定血清白蛋白会受到非白蛋白类蛋白质的非特异性干扰，而BCP试剂的最适pH值为5.20，接近a-和b-球蛋白的等电点，能抑制这两种球蛋白与BCP的非特异性反应，因此对测定白蛋白具有更高的特异性。本试验的结果表明，BCP法测定血清ALB的精密度较好，回收率高，线性范围可达10~80g/L，比传统的BCG法更宽，而且不易受溶血、黄疸和脂血等临床常见干扰因素的干扰。
BCP和BCG这两种方法测定ALB结果的差异，不同的研究者对不同人群检测的结果不尽相同。Blagg等认为，采用溴甲酚绿长反应时间测定法检测健康人血清白蛋白的差值可比溴甲酚紫法高11g/L。与标准的电免疫测定法(eletroimnunoassay)相比，采用BCG短反应时间法测定的非肾病病人血清ALB会偏高7g/L，肾病病人则偏高8g/L。Joseph则认为，BCG法测定ALB与散射比浊法的结果较一致，而BCP法比BCG法测定结果偏低5.2g/L；行血液透析的病人比腹膜透析者偏低更严重。Clase等则认为BCP法测定肾病与非选择性患者、血液透析与其他肾病患者血清ALB的表现一致，比BCG法约偏低5.5g/L，这一观点与Joseph相反。Blagg等的研究表明，BCP法比BCG法偏低5g/L。最近，Carfray认为，BCP法测定血透病人ALB的结果与"金标准"的散射比浊法结果更接近，BCG法测定ALB结果偏高(尤其是高白蛋白血症患者偏高更为显著)，通常比BCP高3.5g/L。
因为缺乏可供比较的"金标准"，本试验的结果并不能说明BCG的结果偏高、BCP结果偏低，抑或两者皆有。国外学者的观点也不尽相同，Joseph等认为BCG法更接近"金标准"，而Blagg、Carfray等却认为BCP法更佳，这也许与各自所采用的标准不同有关。在短时间内，大家不可能接受单一的测定ALB的方法为最终标准方法，更不可能在临床上都应用那一种方法。这两种方法在临床上都广为应用，尽管有人提出放弃BCG法，但这种观点并未被普遍接受，BCP法的人源质控血清和技术转换在一定时间内仍存在一定的困难。因此，BCP和BCG这两种测定ALB的方法在相当一段时间内仍将共存。
本试验的目的不是帮助选择哪一种更好的方法，而是为了解决临床和科研工作中的一个实际问题，即如何比较分析不同方法测得的ALB结果。我们的试验结果表明，用BCP和BCG两种方法测定100份门诊患者血清ALB的结果有显著性差异(P<0.001)，但高度相关(r=0.929)。BCP法比BCG法低5.98g/L(以BCG法为Y，BCP法为X，两法测定结果的回归方程为y=1.08x+5.98)，与上述多位国外研究者的结果非常相近。将近年来推出的BCP法的测定结果按y=1.08x+6作一个简单换算，即可预测BCG法的测定结果，效果非常令人满意。
另外，Dimension RXL使用DADE BEHRING专用配套试剂，利用BCP法测定血清ALB时需先进行三点定标，专用配套标准品为5g/L、42g/L、83g/L，每小瓶2ml，不但价格昂贵，而且复溶后只稳定8h，增加了试验室的消耗。若以去离子水为"0"标准与中间水平的标准品42g/L对仪器进行0、0、42g/L"假三点定标，线性范围良好，测定结果不会受到影响，节约了实验室检测成本。
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