转录组技术的应用(二)

上一次讲解了转录组测序应用方向（一）

转录组测序技术的应用(一）

下面讲解剩余的应用：

1.单细胞转录组测序技术

单细胞转录组测序是转录组测序的一个变种，其用于测序的总RNA的来源单个细胞。通常，不需要总RNA分离，而是对单独收集的细胞直接进行逆转录。文库制备的方法与转录组测序技术相似：将RNA逆转录成cDNA，连接衔接子，加入每个细胞的条形码，并扩增得到ds cDNA。由于RNA种类的复杂性低，有时在测序之前将单个分离的细胞或单独的文库进行合并。在这种方法的一个例子中，收集单个小鼠卵裂球，并对其内容物进行RNA测序。一个实例中，分离来自早期多个发育阶段的秀丽隐杆线虫的单个细胞，并利用总RNA制备文库。通过分析单个细胞的转录物，可以监控每个发育阶段转录物表达情况。

2.基因融合

随着测序Read数量和长度的增加以及双末端测序的应用，识别罕见但潜在重要的转录本的能力增加。融合基因就是这种情况，融合基因是两个先前分离的基因发生融合产生的转录物。融合的对象可以提供5'非编码区域，编码区和3'聚腺苷酸化信号。此事件在发生基因组重排的癌症组织和细胞中出现。细胞遗传学紊乱例如基因组扩增，易位和缺失可以将两个独立的基因结构汇集在一起，发生基因融合。例如，在三种乳腺癌细胞系中使用长度为100或200个核苷酸的文库的双末端测序，共检测到了24个新的和3个已知的融合基因。最近的转录组测序研究发现融合基因存在于正常组织中，表明融合基因事件也可能具有正常的生物学功能。

3. 基因变异

随着转录组测序数据量的累积，使挖掘基因变异的数据成为可能。来自大型的项目和公开文献一般要求数据是公开的。通过下载这些可用数据，利用生物信息学方法可以获取转录组数据中的单核苷酸多态性。在某项研究中，从10倍的覆盖率的转录组测序数据中获得的89％的SNP被证实是真正的突变。单核苷酸多态性检测也可以直接从原始的转录组测序数据中获得。一组胸肌肌肉（利木赞牛）的mRNA进行转录组测序，可以在大于30 M双末端Read中鉴定超过8000个高质量的单核苷酸多态性。这些单核苷酸多态性的一个子集被用于法国九大牛品种的基因分型，证明了这种方法的实用性。

NGS最近的一个应用是鉴定来自基因组DNA样品的蛋白质编码基因序列的变化。被称为“外显子组测序或外显子组捕获”，这种方法在技术上不是转录组测序技术，因为它依赖于通过与外显子序列杂交而富集外显子的片段化的基因组DNA测序。这一直受到人类疾病研究的启发，在这些研究中，需要从大量的个体中识别变异，通常是单核苷酸多态性。即使在今天，对成千上万个人进行测序也是昂贵的，所以捷径就是对个体的外显子序列进行测序。由于外显子绝大部分位于蛋白质编码基因中，因此具有发现对蛋白质结构有直接影响的变异的位点。由于它是NGS最受欢迎的应用之一，因而已经开发了许多商用试剂盒。

4.长链非编码RNA

转录组测序技术的另一个应用是找到存在的转录本，但不编码基因。长链非编码RNA（lncRNA）是在转录组测序技术可用之前就已知。然而，直到转录组测序技术方法能够揭示活细胞中许多不同种类的lncRNAs之后，其存在和普遍性的程度才得到充分认识。一般将lncRNA描述为落在已知非编码RNA（例如tRNA，核糖体RNA和小RNA）外部的转录物，其不与蛋白质编码外显子重叠，并且长度大于200nt。lncRNAs可以通过结合和改变组蛋白蛋白的功能，以表观遗传的方式控制转录增强子（eRNA）。现在可以认识到，lncRNAs可能在诸如阿尔茨海默氏病的疾病中起作用。

5.非编码小RNA

转录组测序技术可用于鉴定小的非编码RNA的序列，结构，功能和丰度。miRNAs（miRNA-seq）是最着名的例子，但是其他小的非编码RNA，如核内小分子RNA（snRNA），微小RNA（moRNAs）和内源性沉默RNAs（endo-siRNAs）也可以使用小的非编码RNA方法进行研究。用于非编码小RNA的方法与转录组测序技术相似。起始材料可以是总RNA或经过长度大小选择的小RNA。大多数常见的测序平台将对小RNA进行测序，一旦它们合成cDNA互补链。因此实验方案的许多差异都会在测序前发生。小RNA不仅在基础生物化学，生理学，遗传学和进化生物学的研究中，而且在医学上作为癌症的诊断工具或在衰老过程中，这些分子的特征都有许多应用。最近对线虫Panagrellus redivivus的研究提出了鉴定了超过 200个新的miRNA及其前体发夹序列，同时还提供了基因结构模型，蛋白质编码基因的注释和基因组序列。

6.扩增产物测序

有时整个转录组不需要测序，只有少数基因需要。虽然总是可以从整个转录组序列分析中获得感兴趣基因的子集，所需的努力，时间和资源可能超过自身所能承受的。通过使用一组由10-200对组成的PCR引物，可以进行逆转录PCR（RT-PCR），而不是克隆每个单独的产物并分离质粒DNA进行Sanger测序，可以对PCR产物池进行测序，获得序列。这在实际应用中主要用于样本数量很大，并且基因的数量很少情况。

供稿：王小布

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