【你真的了解外泌体吗?】系列之——外泌体的分离

2023-05-10 14:56:27

既然外泌体小家伙们功能如此强大,机体构成又这般复杂,我们怎么才能分离得到它们呢?甭着急,小恩马上将分离真经透露给您。

目前可以通过超速离心、过滤、密度梯度离心、免疫亲和/层析、流式细胞分选等多种手段大致分离外泌体,但是这些方法都很难完全纯化到非常纯的外泌体亚群,通常得到的是直径小于200nm的囊泡,因此越来越多的人开始称之为sEV(即 small extracellular vesicle,小细胞外囊泡)。为了严谨,今天我们也以小细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。接下来,请大家跟随小恩一起来揭开外泌体分离的神秘面纱。  

1.     超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体纯化手段,调查显示约有56%的人采用该方法,被称为目前外泌体分离的金标准方法。采用低速离心、高速离心交替进行(如图1所示),可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单,获得的囊泡数量较多而广受欢迎。

原理:首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片;随后,高速离心以去除大囊泡;最后超速离心以沉淀小细胞外囊泡,弃掉含有杂蛋白的上清。

图1

2.     过滤离心法

原理:根据细胞外囊泡直径大小,超滤膜允许小细胞外囊泡通过滤膜而由于细胞、细胞碎片、大直径微泡等直径较大,不能通过滤膜而和小细胞外囊泡分离,从而得到直径小于200nm的小细胞外囊泡(如图2)。

该方法基于孔径筛选,通常与色谱法连用效果更好,但需要专门的HPLC的设备。

图2

3.     密度梯度离心法

原理:正如所有的脂质小囊泡,外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中,其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml,将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上,随后通过离心将外泌体分离(如图3)。

图3

4.     免疫磁珠法

原理是: 外泌体表面有特异性标志蛋白,如CD9,CD63,CD81,CD82,Hsp70,Alix,Rab-5,Annexin,EpCAM,用这些标志蛋白抗体包被的磁珠与外泌体共孵育,可以将外泌体捕获并从溶液中拉下来(如图4)。

另外,由于外泌体的起源不同,具有异质性,所以在不同的外泌体上这些标记物的丰度也有所差异。因此,可以通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体,再将这些抗体固定在ELISA平板或微流体装置上,来对外泌体进行选择性分离。例如,使用抗肿瘤相关的HER2和EpCAM抗体从肿瘤细胞中分离出来源于肿瘤的外泌体。

图4

5.     色谱法

原理是:利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系对溶质进行分离的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔,只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱,首先被流动相洗脱出来;小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞,在柱中受到更强地滞留,更慢地被洗脱出(如图5)。

图5

6.     聚合物沉淀法

原理:聚乙二醇(PEG,8000 kDa)可竞争性结合游离水分子,从而使溶解度较小的分子或外泌体从溶液中析出。早期该方法被应用于从血清等样本中分离病毒,现也被用来沉淀外泌体。通常是4℃用PEG与样品孵育过夜,随后通过低速离心或过滤即可沉淀回收外泌体。

不同的分离方法各有利弊,目前并没有单一的最优方法来分离获得纯净的外泌体,因而方法的选择取决于下游的应用及科学问题,如下是几种外泌体分离方法的比较,大家可根据自己的实验条件及需求,选取合适的方法进行分离。

小恩拜读了一系列以外泌体为研究基础的文献,大部分高水平杂志采用法国居里研究院Théry C教授潜心研究的超速离心法。虽然方法看来简单,操作起来却有一定技术含量,小恩家已投身超速离心多年,在这方面还是有一定积累沉淀,欢迎感兴趣的朋友来电交流哈。

 

PS:小恩家专注于外泌体的临床转化,提供医学(特别是肿瘤领域)外泌体研究整体解决方案,如金标准外泌体分离、鉴定,全转录组测序等,各位看官如果有这方面需求,记得来找我哦。。。

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北京恩泽康泰生物科技有限公司致力于提供从分离鉴定到分析验证一站式外泌体整体解决方案。由世界外泌体研究领域顶级专家、澳大利亚技术科学与工程院院士Richard Simpson教授与来自UCLA、LTU和国内顶级学府的技术研发和管理团队共同携手创立。在外泌体领域已有10余年积累,建立了多种分离富集方法,实现稳定、快速、操作简单及低成本的外泌体分离鉴定体系,为外泌体的科学研究与临床应用奠定良好基础。

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