文章解读 | DNA断裂修复通路可上调癌细胞中PD-L1的表达

DNA DSB是遗传毒性应激最关键的类型，尽管有越来越多的研究证明外源性细胞应激诱导癌细胞中的PD-L1上调，但尚未有研究表明DSB参与PD-L1的表达。在本篇研究中，研究人员揭示了DSB修复涉及的PD-L1表达并且提供了对DSBs调节PD-L1表达机制的认识。这种对癌细胞PD-L1表达的分子机制的新理解有助于预测预后的发展，并可能有助于改善DNA修复缺陷型癌症的治疗效果，特别是当抗PD-1疗法和放射/化疗结合治疗时。

1.细胞培养，辐射和药物治疗

U2OS、H1299和DU145细胞来自美国典型培养物保藏中心。

a. 在含有10％胎牛血清（FCS）的Eagle's Minimum EssentialMedium中培养癌细胞。

b. 用铜（0.5mm）-铝（1.0mm）过滤器在100kVp和20mA条件下下进行X射线照射。

注：剂量率设定为0.5Gy /分钟。

c. 以剂量为100/500nM加入拓扑异构酶II抑制剂Etp，孵育细胞。以剂量为500nM加入APH（一种复制型聚合酶抑制剂），培养细胞。另外，10μMATM抑制剂（ATMi），10μMATR抑制剂（ATRi），Chk1抑制剂为DNA损伤诱导提前30分钟将其加入。PARP抑制剂（PARPi）以剂量为10μM加入，并且培养基每48小时用10μM PARPi重复加入直至到达指定的时间点。

2.siRNA敲除

a. 使用HiPerFect（Qiagen）进行siRNA转染。

b. 胰蛋白酶消化后，将siRNA加入到悬浮细胞中。24小时后，胰蛋白酶消化后，用悬浮细胞中的siRNA重新转染细胞。

c. 第二次转染后将细胞孵育24小时，然后进行DNA损伤诱导。

3. 免疫印迹和免疫荧光

a. 通过免疫荧光染色定量细胞表面的PD-L1信号，细胞用3％多聚甲醛-2％蔗糖固定，然后用抗-PD-L1抗体，碘化丙啶和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚对固定的细胞进行染色。

b. 使用DS-Qi2相机对使用带有40x倍物镜的显微镜的NIS-Elements D成像软件拍摄代表性图像。

c. 通过ImageJ v1.48测量DAPI阴性区PD-L1的平均信号强度。从这个分析中排除了代表死细胞的PI阳性细胞。

4. 通过实时PCR定量mRNA表达水平

a. 在DNA损伤诱导后的指定时间点，使用NucleoSpin RNA从细胞中提取总RNA。

b. 使用StepOnePlus进行定量PCR（qPCR）。将表达水平标准化为GAPDH，并使用2- ΔΔCt计算方法进行计算。

5. PD-L1的表面流式细胞术分析

a. 暴露于10Gy X射线或PAPRi后，使用/不使用抑制剂将癌细胞孵育48小时后收集用于流式细胞术分析。

b. 通过在1mM EDTA-PBS中不经胰蛋白酶消化而抖落收获贴壁细胞。收获的细胞用冰冷的1mM EDTA-PBS洗涤，然后在冰上用抗-PD-L1抗体染色20分钟。

注：在分析中排除由PI检测到的死细胞

c.  Attune NxT流式细胞仪上进行分析。计算MFI（PD-L1-同种型）：将MFI（PD-L1）减去MFI（同种型对照）。

6.数据分析

a. 由癌症基因组图谱（TCGA）项目提供的归一化的RNA序列和突变状态数据, 数据从基因组数据共享数据门户下载（http://tcia.at/）。

b. 根据以下两个条件选择分析研究：野生型PD-L1（总N）病例数超过300例；各组基因突变病例数超过1％的总N。

c. 使用Mann-Whitney U-检验比较具有/不具有突变的BRCA2，PALB2，Ku70/80或这四种基因中的任何一种的样品。

1.癌细胞中DNA损伤上调PD-L1

图1 癌细胞中DNA的损伤上调PD-L1表达

通过免疫印迹分析检测PD-L1蛋白质水平，电离辐射（IR，ionisingradiation）后，在骨肉瘤（U2OS）、肺癌（H1299，A549）和前列腺癌（DU145）细胞系中以时间和剂量依赖方式诱导DSBs使得 PD-L1的表达上调（图1a，b）。本研究采用U2OS细胞，因与其他癌细胞系相比，其完整的DNA损伤应答被广泛用于DNA修复和信号传导的分析。因此，上述发现表明在IR后活细胞中发生了PD-L1的上调。相比之下，在DNA损伤后，未在初级成纤维细胞（48BR）中观察到明显的PD-L1上调。为了在免疫印迹分析中验证针对PD-L1的抗体特异性，研究人员使用PD-L1siRNA进行实验。暴露于PD-L1 siRNA使得PD-L1信号消失，证明了IR诱导的信号代表PD-L1（图 1c）。

为了解决PD-L1表达是依赖于DNA损伤信号还是IR特异性应答这个问题，将细胞用喜树碱（CPT;拓扑异构酶I抑制剂，能够引起单链断裂并使处于S期的细胞形成复制相关的DSB）、阿非迪霉素（APH;DNA聚合酶抑制剂，能够导致DNA复制相关的损伤）或依托泊苷（Etp;直接引起DSB的拓扑异构酶II抑制剂）处理，观察到PD-L1表达显著增加（图1d，e）。此外，DNA损伤化疗药物顺铂（CDDP），丝裂霉素C（MMC）和替莫唑胺（TMZ）也可上调PD-L1的表达。

为了证实DNA损伤在转录水平上调后使得PD-L1蛋白增加，采用实时PCR定量mRNA的方法。研究发现在IR，Etp，CPT或APH处理后16-48小时内PD-L1的mRNA上调（图 1f ）。DNA损伤后也观察到PD-L2表达量增加（图 1g）。为了进一步检测细胞表面上的PD-L1表达，通过流式细胞术测量了PD-L1的平均荧光强度（图 1h）。研究观察到，使用IR，Etp，CPT或APH处理后，在U2OS，H1299和DU145细胞系中观察到了PI阴性细胞（活细胞）的细胞表面PD-L1上调（图 1h）。培养基中的IFNγ增加了PD-L1的表达，虽然这种表达量的增加可能不是协同作用，但继续使用IR诱导，PD-L1表达依旧增强。

综上所述，这些发现显示PD-L1表达上调在活体DNA损伤的癌细胞中应答，尤其是DSBs。这表明癌细胞中的PD-L1表达受DNA损伤信号的调节。

2.DSB之后PD-L1上调需要ATM的活化

图2  DSB之后PD-L1上调需要ATM的活化

DSB是最关键的DNA损伤类型并且能激活DNA损伤信号。Etp直接诱导DSB，而其他DNA损伤剂（CPT，APH，CDDP，MMC和TMZ）也可通过DNA复制间接诱导DSBs。ATM抑制剂显著抑制IR-，CPT，Etp-而APH诱导PD-L1表达，表明PD-L1的表达依赖DSB损伤信号传导而上调（图 2a）。

为了证明激活ATM需要PD-L1在DSBs中应答，研究人员检测了暴露于NBS1 siRNA细胞的PD-L1。结果发现，在NBS1耗尽的细胞中PD-L1上调减少，证实了在DSB之后PD-L1上调需要ATM的活化（图 2b ）。使用ATM抑制剂来抑制PD-L1 mRNA的表达（图 2c）。在瞬时激活ATM之后，DSB修复的进程促进信号激酶从ATM切换到ATR，然后Chk1被激活。

为了检测在特定的ATR或Chk1抑制剂（ATRi或Chk1i）存在的情况下，PD-L1上调是否需要下游激酶，即对ATR和Chk1，IR处理后的PD-L1水平进行检测。值得注意的是，ATR或Chk1抑制剂基本上可以对IR诱导的PD-L1上调进行抑制（图 2d）。另一种Chk1抑制剂（MK8776）也抑制PD-L1上调（图 2e）。此外，Chk1抑制剂显著降低了PD-L1 mRNA的上调（图 2f）。U2OS，H1299和DU145细胞表面的PD-L1上调被Chk1抑制剂显著抑制（图 2g）。

总之，研究数据表明，通过修复活细胞中的DNA损伤信号通路，能够促使PD-L1表达上调。

3.DSB之后BRCA2的消耗增强了PD-L1的上调

图3 检测IR后影响PD-L1上调的因素

上述发现确定了DSB修复和信号中调节PD-L1表达的因子。为了鉴定在IR后PD-L1上调的DSB修复因子，研究人员使用针对DSB修复和信号传导的siRNA文库进行筛选。与siControl相比没有DNA损伤，尽管表达显示siRNA之间存在差异但siRNA的PD-L1表达没有实质性增加（图3a）并且Ku80，BRCA2或PALB2的消耗大大增强了IR诱导的PD-L1上调（图3b）。

图4 DSB之后BRCA2的消耗增强了PD-L1的上调

与第一个siRNA筛选中的数据一致，在IR诱导后通过使用另一个siRNA靶向BRCA2从而大幅度增加PD-L1的表达（图4a）。在BRCA2基因缺陷的细胞中PARP抑制剂被用来诱导合成致死，因为它阻断单链断裂修复，构成具有细胞毒素的DSBs。因此，研究人员测试了在BRCA2耗尽的细胞中PARP抑制是否导致PD-L1表达的增加。结果发现，在BRCA2耗尽的细胞中PARP的连续处理使得PD-L1的表达显著上调（图4b）。PARP抑制剂增强PD-L1的表达并且Chk1抑制剂也显著被抑制（图4c）。

此外，IR后，使用ATMi或Chk1i抑制剂使得BRCA2耗尽细胞中的PD-L1 mRNA表达增强（图4d，e）; 类似地，经过IR诱导后在H1299细胞中通过Chk1抑制剂抑制PD-L1 mRNA的表达。在U2OS和H1299细胞中，IR或PARPi诱导后通过加强BRCA2的消耗使得细胞表面上的PD-L1上调。值得注意的是，Chk1抑制剂抑制细胞表面PD-L1的表达（图4h-k）。证明在BRCA2去饱和细胞中PD-L1的上调需要Chk1活性。总之，上述结果表明在DSBs之后BRCA2是调节PD-L1表达的关键因子。

4.在DSBs后Ku复合物的消耗增强PD-L1的表达

图5 在DSBs后Ku复合物的消耗增强PD-L1的表达

除了在BRCA2耗尽的细胞中发现PD-L1的表达大幅上调之外，研究还发现在IR诱导后Ku80 siRNA能使PD-L1显著增加。同样的，Ku70 siRNA 也增加了PD-L1的上调（图5a）。Ku70或Ku80的消耗会导致Ku70 / 80复合体的破坏（图5a）。Ku70 / 80复合体在DSB修复中扮演两个重要角色。一个是诱导非同源末端连接（NHEJ）因素来启动修复过程的下游部分，另一个是保护DNA末端免受DNA核酸酶的不定期消化。由于DSB依赖的PD-L1表达需要具有活性的Chk1，而单链DNA复制蛋白A（RPA）上的ATR可激活Chk1的活性，研究人员假设在IR诱导后，Ku80耗尽的细胞中PD-L1的大幅上调可能是由于DNA末端切除后使得Chk1过度激活所致。为了解决这个问题，研究组通过监测RPA Ser4/8（切除标记）和Chk1 Ser345的磷酸化来分别检查切除活性和Chk1信号（图5b）。进一步检测术后PD-L1是否增加和Chk1活性是否需要DNA核酸酶，研究人员使用EXO1（其是HR修复中的主要DNA外切核酸酶）的siRNA进行实验。IR诱导后，当EXO1/BLM siRNA的细胞中的Ku80耗尽后检测RPA/Chk1磷酸化（NB消耗BLM，需要DNA解旋酶，因为它协同促进HR中的EXO1依赖性切除）。研究发现，EXO1/BLM消耗显著降低了Ku80耗尽细胞中的RPA/Chk1磷酸化，这表明在Ku80消耗的背景下EXO1/BLM对于切除和Chk1活化是必需的（图5b）。

接下来，研究人员检查了Ku80耗尽细胞中PD-L1上调是否依赖于EXO1/BLM。结果表明，EXO1/BLM的消耗削弱了IR诱导的Ku80耗尽细胞中的PD-L1上调（图5c）。为了进一步分析Ku80耗尽细胞中PD-L1上调是否需要具有活性的Chk1，研究人员对细胞进行Chk1i处理后进一步检测PD-L1的表达状况。在Ku80耗尽细胞中Chk1抑制剂显著降低PD-L1的上调（图5d）。再使用Etp处理，对PD-L1的表达进行检测，结果发现PD-L1进一步上调（图5e）。Etp诱导后，在Ku80消耗细胞DSB切除末端有大量的RPA病灶增加（图5f）。ATM或Chk1活性的抑制也削弱了PD-L1mRNA的上调（图5g）。此外，观察到Ku80消耗导致的PD-L1细胞表面的表达增强，而PD-L1细胞表面的表达被Chk1抑制剂所抑制（图5h-j）。上述结果表明，Ku70/80复合物消耗通过Chk1激活后增加的EXO1/BLM依赖性切除来上调PD-L1表达。

5.DSB后通过IRF1通路介导PD-L1上调

图6 DSB后通过IRF1通路介导PD-L1上调

有研究表明，IFNγ处理后的JAKs-STATs-IRF1通路主要调节PD-L1表达。因此，研究人员检查了DSB是否诱导STAT1，STAT3和IRF1通路的激活，研究发现在U2OS和H1299细胞中IRF1和STAT1/3磷酸化被上调并在DSB（IR，Etp或CPT）上应答（图6a，b）。IR诱导后，IRF1的消耗显著降低了PD-L1的上调，表明DSB依赖性PD-L1上调是由IRF1途径介导的（图6c）。此外，从结果中发现IR诱导后，在IRF1耗尽的细胞中STAT1 Try701没有有效磷酸化，这表明从IRF1到STAT1的磷酸化有反馈。为了探究ATM/Chk1信号在IRF1激活中的参与状况，IR诱导后，通过使用/不使用ATMi/Chk1i来检查IRF1水平。研究结果表明，ATM或Chk1活性抑制剂降低了IRF1表达（图6d，e）。IR诱导后，IRF1 siRNA消除PD-L1细胞表面上调（图6f，g）。总之，上述结果表明DSB依赖性信号上调PD-L1的表达并且这种上调需要STAT1/3-IRF1途径的激活。

最后，研究人员基于TCGA中的数据集检测肿瘤样本PD-L1的水平，研究结果发现，具有BRCA2，PALB2或Ku70/80突变的肿瘤（乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌和子宫癌）中的PD-L1比没有上述突变的肿瘤表现出更高的表达。可能是Chk1突变样品的数目较少的原因，有Chk1突变的肿瘤表现出较低PD-L1表达的趋势。而具有p53基因突变的肿瘤没有表现出PD-L1表达的增加。

本项研究证明了DSBs的修复是调节癌细胞中PD-L1表达的因子。研究结果发现，在使用IR、CPT、APH或Etp处理后，癌细胞中PD-L1是依赖ATM/ATR/Chk1上调。该过程对上述激酶的需求支持了在活细胞中使用DSB诱导后PD-L1的上调受DNA损伤信号传导控制的观点。DNA损伤的细胞逐渐死亡或在1-2周内由于细胞衰老而停止生长。在10Gy X射线照射后，尽管90％以上的细胞都没有存活，但PD-L1表达水平在存活细胞中恢复正常。诱导DNA损伤细胞中PD-L1的这种瞬时上调，可以防止肿瘤周围的免疫活性过度激活。研究进一步表明，当特定的DSB修复蛋白BRCA2或Ku70 / 80被耗尽时，PD-L1的上调增强。研究人员认为DSB本身的修复不是调节癌细胞中PD-L1的表达因子，而DNA末端切除后Chk1的活化是导致PD-L1上调的关键步骤（图7）。

图7 DSB诱导反应信号通路导致PD-L1上调的模型

总之，在本研究中，结果显示BRCA2或Ku80的消耗在DSB信号级联中使得PD-L1表达上调。siRNA筛选显示DSB修复基因的下调不总是与PD-L1上调相关。值得注意的是，研究人员证明了调节Chk1活性的因素是研究的关键。因此，本研究中鉴定的BRCA2，PALB2和Ku70/80可能是预测联合PD-1和放疗/化疗疗效的良好标志物，无论基因状态如何，联合治疗可能是最有效的治疗方案。最后，研究人员建议深入探究放射性/化疗引起DSB诱导反应的信号通路导致PD-L1上调，对于开发预后分子标记物和PD-1阻断癌免疫治疗具有重要意义。当联合PD-1和放疗/化学疗法施用时，这些因素可能是影响疗效的药物靶点。这些未解决的问题将在未来的工作中进行进一步研究。

近些年随着免疫治疗的发展，PD-1/PD-L1成为免疫治疗最热门的治疗靶点。所以对DSB修复涉及的PD-L1表达和DSBs怎样调节PD-L1表达的机理性认识的深入研究有利于免疫治疗的进一步发展。就小编个人而言，人类癌症的研究犹如对宇宙的探索，工程浩大并且目标盲目，所以本项研究通过DNA断裂修复通路的研究来观察癌细胞中PD-L1的表达的状况可能是这伟大工程中的一块基石，它帮助科研人员深入研讨人体的秘密。

参考文献：

[1] Hiro Sato,Atsuko Niimi, et al. DNA double-strand break repair pathway regulates PD-L1 expression in cancer cells[J]. nature communications, 2017.

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