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基于结构的合理设计,提高嗜碱单胞菌碱性淀粉酶的耐热性

TUST微生态调控与分子药理研究室 2020-02-13 16:23:36

蛋白质通常会在内部形成一个疏水核心,而在其表面则分布着一些带电氨基酸,这些分布在蛋白质表面的带电氨基酸可以通过电荷间的相互作用,给蛋白质形成一个保护网,增加蛋白质对高温的抗性。同时表面的氨基酸对蛋白质整体构象的影响较小,相应的对酶活的影响也较小。带电氨基酸(Arg、LysHisAsp Glu)通常暴露于蛋白表面,它们能够与周围基团形成大量盐桥与氢键作用。5 个带电氨基酸中,Arg 被认为与酶的热稳定性相关。因为 Arg 特殊的带电胍基侧链能够通过 3 个不对称的氮原子形成趋于 3 个方向的相互作用,参与形成大量静电作用。

Arg 的 pKa值接近 12,比 Lys pKa值高出一个 pH 单位,并且 Arg 具有较高的共振稳定性。因此在一定温度下,Arg Lys 更能维持静电作用和净正电荷。根据文献报道,将酶分子表面的 Lys 替换成 Arg可以提高一些酶的热稳定性;将蛋白表面的 Asn、Gln、Ser 替换成 Arg 也被报道能提高酶的热稳定性;此外,在氨基酸组成上的差异,如 Arg 含量的增加或者 Ser 含量的减少,也都被证明与酶的热稳定性相关


    2014年,江南大学的Deng Z等人,在《Appl Microbiol Biotechnol》杂志(IF2016=3.42,工程技术2区)发表了题为“Structure-based rational design and introduction of arginines on the surface of an alkaline α-amylase from Alkalimonas amylolytica for improved thermostability”的文章。


    文章中所用的主要方法:

    1、计算机辅助建模:使用SWISS-MODEL在线工具进行蛋白质三级结构的预测,一般而言,蛋白结构预测需要通过几个步骤,首先是搜索蛋白数据库(例如Swissprot)找到目的蛋白的同源序列,从一系列同源序列中选择几个或者一个作为模板;将目标蛋白再次与模板进行比对,在保守位置补充空位进行对齐;调整目标蛋白序列中主链各个原子的位置,产生与模板相同或者相似的空间结构;再利用能量最小化原理,使目标蛋白的侧链基团处于能量最小的位置,最终确定蛋白的三级结构。

    2、定点突变

    3、圆二色谱:圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法,是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定,较接近其生理状态。而且测定方法快速简便,对构象变化灵敏,所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一,并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。CD 扫描得到的数据通过 DichroWeb 在线服务器计算出突变前后蛋白样品在α-螺旋和β-折叠含量方面的百分比估算值。

4、荧光光谱法:荧光光谱法指的是通过测定蛋白质分子的自身荧光,或者向蛋白质分子特殊部位引入荧光探针然后测定其荧光,来研究蛋白质分子的构象变化,或者是研究色氨酸和酪氨酸残基的微环境,或者是蛋白质变性等。它是研究溶液中蛋白质分子构象的一种有效方法。荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简单等优点。该方法在蛋白质分子构象研究中得到越来越广泛的应用。

5、差示扫描量热法:一种可以用来研究生物膜结构和功能、蛋白质和核酸构象变化等的热分析法。在程序控制温度下,测量输入到试样和参比物的功率差(如以热的形式)与温度的关系。差示扫描量热仪记录到的曲线称DSC曲线,它以样品吸热或放热的速率,即热流率dH/dt(单位毫焦/秒)为纵坐标,以温度T或时间t为横坐标,可以测定多种热力学和动力学参数,例如比热容反应热、转变热、相图、反应速率、结晶速率、高聚物结晶度、样品纯度等。该法使用温度范围宽(-175~725℃)、分辨率高、试样用量少。适用于无机物有机化合物及药物分析。


    文章主要内容摘要如下:

在本研究中,作者通过结构的合理设计在蛋白质表面引入多个精氨酸,进而明显的提高了一株来自于嗜碱单胞菌的碱性α-淀粉酶的热稳定性。基于一个三级结构的分析,有7个氨基酸残基——谷氨酰胺(Gln) 166、Gln 169、丝氨酸 (Ser) 270、赖氨酸 (Lys) 315、Gln 327、天冬酰胺 (Asn) 346、Asn 423——被选为替换成精氨酸的目标氨基酸。七个单突变中的五个突变株S270R, K315R, Q327R, N346R, and N423R 的热稳定性得到了增强。五个位点的复合突变-S270R/K315R/Q327R/N346R/N423R与野生型进行对比时,在60℃下的半衰期提高了6.4倍,解链温度提高了5.4℃。同时,此突变体酶的最适温度、最适pH以及催化效率都得到了显著的提高。突变的酶在最适pH值上有一个大的转变,从9.5变为了11.0。此外最适温度也从50℃提高到了55℃,kcat/Km值从1.8×10^4 提高到3.6×10^4 L/(g·min)。通过比较分析野生型酶和突变型酶的结构,作者发现突变型酶分子内的相互作用有助于提高热稳定性。本研究中的耐热性突变酶在纺织工业具有潜在的应用价值。