生物样本库BS小组
摘要
目的：在加拿大儿童参考区间实验计划(CALIPER）项目中，对从健康儿童收集的儿科血清样品在-80℃下进行各种时间段储存。 本研究旨在确定在这些条件下化合物、蛋白质和激素分析物的稳定性。
方法：收集门诊0-18岁儿童的血清样本合并到单个样本池（pool）或年龄组特定池（pool）中。测量基线后，将每个池样本等分并在-80℃冷冻保存直至分析。储存的10-13个月期间，每月对样品中的57种生化标记物进行分析，并且在分析前对每个等分样本仅有一次冻融。检测分析系统为：VITROS®化学系统、COBASINTEGRA®400Plus和IMMULITE 2500。将每月间隔获得的值与基线测量值进行比较，检测样本值随着时间的变化趋势。
结果：同基线相比，本研究中测量的大多数分析物在长达13个月的储存中没有显著的时间依赖性变化或趋势。经过10个月的存储，PTH相比于基线下降27.2％，测量值在两个月后出现明显下降。大多数分析物显示出随时间的变化，其反映的应是测定变异性而不是分析物稳定性的变化。
结论：本研究显示在-80℃下储存长达13个月的血清中大多数分析物的稳定性。除了PTH之外，其他样本选择分析物参考区间不需要立即测试。
参考区间通常用于患者检查结果的解释。对于儿科等特定患者来说，基于人群的准确的参考区间往往并不适用。儿童发育过程中发生的生理相关变化可能导致检测结果参考区间的变化，因而，参考区间可能具有年龄、性别、青春期发育阶段、种族或地理位置的特异性。
加拿大儿童参考区间实验计划(CALIPER）旨在建立受到年龄、性别、青春期发育阶段和种族分区等变量影响的分析物的全面的儿科参考区间数据库。对一些重要的临床化学、蛋白质和激素，已经通过社区招募的健康参与者建立了参考区间。不同仪器平台之间的参考区间也要测定，如有必要应为每个平台建立单独的参考区间。初始参考区间的确定还应对代谢稳定的门诊患者进行系列分析。
除了倡导建立当前可用的参考区间，CALIPER项目的一个主要目标是对健康和门诊儿童建立定期更新的生物样本库。生物样本库将是当前生物标志物在未来新的分析平台进行参考区间更新和验证的资源，也将是新的生物标志物参考区间建立很好的资源。
生物样本库存储样品的主要问题之一是分析物的稳定性。在建立新的参考区间之前必须确保生化标志物的稳定性。CALIPER计划的大多数生物标志物以前被报告是稳定的，然而由于储存条件、样品处理或基质的差异，-80℃下进行各种时间段储存，这些靶标的稳定性在文献报道中仍存在差异。CALIPER子研究旨在通过实验评估在-80℃下储存长达13个月的血清样品中的关键的化合物、蛋白质和激素生物标志物的稳定性。
方法：
样本收集和分析系统：
该研究在加拿大多伦多儿童医院展开。本研究中儿科剩余标本的使用经过疾病儿童医院研究伦理委员会批准。来自门诊0-18岁儿童血清样品收集在含凝胶血清分离器的塑料真空管中，20分钟形成凝块后离心，4℃短暂保存。随后，血清样本合并到单个样本池（pool）或年龄组特定池中（0-30天，1周-1岁，1-5岁，6-10岁，11-14岁，15-18岁）。测量基线后，将每个池分装并在-80℃冷冻保存直至分析。储存10-13个月，每月分析样品中的57种生化标记物，每等分样本在分析前仅有一次冻融。在VITROS®化学系统、COBASINTEGRA®400Plus和IMMULITE 2500上进行分析。
统计分析：
储存后每月对样本进行检测，通过计算相对于基线（tbaseline）的百分比变化来评估分析物的稳定性，公式如下：（（tx-tbaseline）/ tbaseline）*100; x =储存时间（以月来计算）。计算分析物浓度对时间的线性回归和斜率显著性。计算每个分析物在13个月中的每月检测结果的平均值、标准偏差、变异系数（CV）、基线的最大差异。
为了评估检测测定性能的变化，每次检测的质量控制（QC）数据的CV进行计算。为了评估试剂批号更改和重新校准造成的变化，对10-12个患者样本在每次试剂批号改变和校准前后的百分比变化进行计算，公式如下：[(x2−x1)/x1*100;x1=试剂批号改变和校准前分析物浓度, x2=试剂批号改变和校准后分析物浓度]；计算10-13个月间的平均百分比变化。13个月的总测定变异性计算公式如下：√((averagepatient comparison)2+CV2)。所有分析由MicrosoftExcel 2010计算获得。
结果：
血清样本合并后划分到单个样本池（pool）或年龄组特定池中（0-30天，1周-1岁，1-5岁，6-10岁，11-14岁，15-18岁）。测量基线后，将每个池分装并在-80℃冷冻保存直至分析。储存10-13个月期间每月对分析物检测一次。应注意，新鲜样本中的以下几种分析物的基线测量并不适用：“所有年龄”池中的钠、钾，硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）和胰岛素样生长因子（IGF-1）；除了“1-30天”池之外的所有年龄特异性池中的皮质醇；“所有年龄”池和“1-30天”池的甲状旁腺激素（PTH）；所有年龄池中叶酸、IgE、胰岛素。
最初等分的样本值用做基线计算百分比差异。结果显示为原始值或相对于基线值的百分比差异（图1-3）。每个分析物的平均值、标准偏差、变异系数（CV）、基线的最大差异（所有年龄组见表1-2）和所有分析物的检测见表3。每次试剂更换或重新校准后获得的每月QC数据和患者比较数据用来评估分析时间段内的测定变异性（见表1和表2中的仪器间差异(instrument variation)）。此外，检测在不同时间获得的“所有年龄”池和“特定年龄”池中的基线(图1-3中2009年10月和 2010年2月)，随后分析对样本进行等分。不同储存时间的两个不同样品池提供了对测定变异性的影响的额外质控。相对于“特定年龄池”评估“所有年龄”池中等分样本的趋势或漂移，以及试剂批号更改和重新校准后特定等分样本的趋势或漂移。所有池中的样本存储同样的时间后进行分析，而不是在特定的时间分析，这样预期分析物浓度的任何偏移或趋势可归因于真实的不稳定性效应。在分析的时间段内大多数分析物测量出现变化，并且这种可变性有时超过预测性能的可变性。在“所有年龄”池中，葡萄糖、尿素、肌酐、氯化物、钙、磷酸盐、总蛋白，未结合胆红素、总胆红素、AST、ALT、，淀粉酶、总CO2、HDL、AAGP、AAT、IgA、IgM、TT3、GH，FSH和FT4的CV大于测定变异性（表1-2）。至少在一个特定年龄池中，大多数分析物为预测的变异性CV。观察几种分析物检测中的特定模式（斜率或偏移的显著性）。“所有年龄”池中几种分析物（肌酸酐，白蛋白，总胆红素和淀粉酶）为显著性负斜率（表1）；在“特定年龄”池中，未结合胆红素、ALT和皮质醇在至少一组特定年龄池中为显著性正斜率，总胆红素，淀粉酶、血浆铜蓝蛋白、LH、FSH、TSH和PTH为显著性正斜率。
表1： 使用VITROS® 5,1 FS and 9500 Chemistry Systems测量的各种分析物相关参数
表2-A 使用COBAS INTEGRA® 400 Plus测量的各种分析物相关参数
表2-B 使用IMMULITE® 2500测量的各种分析物相关参数
肌酐检测结果显示：在“所有年龄”池中储存5个月后的变化和在“特定年龄”池中储存2个月后的变化类似。因为所有池中肌酐浓度的变化在批次改变/再校准事件之后发生，而不是存储相同时间发生，因而肌酐浓度的变化可能反映了试剂批号变化/重新校准事件（图1G-H）。AAGP、AAT、ALKP、淀粉酶、AST、钙、血浆铜蓝蛋白、CK、HDL、FSH、GH和维生素B12也在批次改变/再校准事件之后发生类似的浓度变化。
年龄特异性池中的总蛋白值在几个月内一过性下降高达11.1％，然后恢复到接近基线值。在“所有年龄”池中，可在单个等分样本中观察到总蛋白值增长了14.5％，这种高值是相对于“特定年龄”池的基线水品而言的。在“所有年龄”池的基线分析发生试剂批次改变和“所有年龄”池的随后等分分析和“特定年龄”池的基线/等分分析可以解释观察到的结果。同样，GGT、LH的批次改变/再校准事件之后发生类似的浓度变化。相反，相对于“特定年龄”池基线水平，ALT在批次改变/再校准事件之后检测值下降。样品中低浓度分析物偏差较大。我们发现在“所有年龄”池中的所有等分样本FT4相对于基线水平发生的负移位，在“特定年龄”池中则没有发生这样的变化。此结果表明特定年龄”池基线水平测定后FT4检测值受到了试剂批号更换/重新校正事件影响（图3C-D）。
低浓度的胆红素级显示出高CV值。此外，我们观察到相对于基线大的周期性改变与试剂批次改变/重新校准相关。低胆红素浓度的样品中具有较大的百分比降低。
几种分析物测量值的显著变化只发生在“特定年龄”池。例如“1-30天”年龄池中所有等分样本的尿素平均下降15.6％。仅在“11 – 14岁”池中铁的一过性减低高达44.8％，然后回到基线水平。在“1-30天” 池中触珠蛋白出现46.9％的大的负移位。“1-30天” 池中IgM、转铁蛋白检测值也出现类似地大的负移位。特定池中分析物较低的浓度可能解释了铁、触珠蛋白、IgM和转铁蛋白的观测值（上述结果见附件）。
在所有池中PTH值持续下降。10个月的储存后PTH降低高达22.7％，大多数在2个月后就明显下降（16.6%，图3K-L）。每个分析物的稳定性的总结解释见表3。
表3 分析物稳定性概要
讨论：
除了PTH，对基线相比，本研究中测量的大多数分析物在-80℃长达13个月的储存中没有显著的时间依赖性变化或趋势。分析物测量的变化有时超过预估性能的变化。由于室温和蒸发效应以及在样本等分之前新鲜样品的不充分均匀，可能造成分析物等分样本的检测值受到解冻后分析时间的影响。此外，从患者平均样本比较预估的变异性和QC数据可能会造成对稳定性测试性能的高估。例如：一些分析物（胆红素），在极低浓度下基于QC数据的预测并不精确。因而，可以进行替代研究设计：在不同的时间段同时对存储的等分样本进行分析能够减少测定性能变异带来的影响。然而，对于CALIPER这样的参考区间计划，基线样品定期收集是不可行。
选定样本池中某些分析物（如“1-30天”池中的IgM,某些池中的胆红素）有时相对于基线的百分比降低更大，最大的原因可能是由于分析物浓度较低造成的。胆红素浓度的降低可能是在样品制备和分析期间曝光引起的。此外，我们并没有在“特定年龄”之间发现分析物稳定性的一致性差异，表明该研究中检测的变异超过年龄相关的稳定性效应。所有等分样本在分析前仅进行一次冷冻/解冻循环。在所有池中的所有等分样本的所有分析物中并没有出现相对于基线一致性下降，表明一次冻融循环效应缺乏显著性。
以前的研究也曾对大多数分析物在-20°C至-80°C的短期储存（小时，天）或长期存储（几年）后的稳定性进行分析。然而在其他研究中，尽管在不同的储存条件下（时间、温度、基质），一些分析物的稳定性发生了显著变化。少数研究检测到存储后酶活力的稳定性降低： -80℃储存的血清在六天后ALT活性降低8％，在一个月失去16±25％的活性；血清样品在-25℃下储存2年和25年，ALT活性分别损失了41.1％和73.4％的；在-10℃短期储存后，血清中ALKP的活性降低；在-25℃下储存2年和25年，CK活性降低显著分别为41.1％和96.1％。ALT和CK可能在长期储存期间经历活性位点残基的修饰，从而导致酶活性的丧失。AFP在-20℃和-60℃中不稳定；在-80℃下12个月后，EDTA血浆中的甘油三酯降低；在-70℃储存长达7年中，血清中的胆固醇降低2.06％/年，甘油三酯2.8％/年， HDL 1.3％/年；在另一项研究中，样品在-80℃储存12小时后，胆固醇和HDL显示血清轻微下降；在-25℃下储存2或25年的血清样品中，观察到其他几种分析物的显著变化：转铁蛋白（+ 8.2％）、白蛋白（-1.9％）、铁蛋白（-18.5％）、钾（+ 26.4％）、钙（+ 7.4％），钠（+ 3.9％）、尿酸（-7.6％）和胆红素（-59.4％），括号表示25年后的百分比变化。在-80℃下储存8-11年后观察TSH减少，FT3和FT4增加。在-25℃下冷冻6个月的样品对甲状腺激素没有影响，然而在2-23年的储存后，FT4相对于储存6个月后测定值略微增加（5.5％）；TSH，FT4和FT3在4°C储存6天后测定值不受影响。
我们的结果表明PTH值随时间的变化明显下降。先前也已经观察到PTH不稳定性，对在-80℃下储存长达两年的血清/血浆样品进行检测发现：在Liaison上测量的PTH在EDTA中最大稳定性最多维持2个月，在血清中具有9个月的最大稳定性，而在Elecsys上测量的PTH显示稳定性为2年。
分析物的稳定性可能受血清分离前暴露于红细胞的时间的影响。由于受到红细胞破坏或释放的酶的影响，全血中的分析物稳定性可能会降低。例如：EDTA全血在4℃或24℃储存24小时，胰岛素浓度会降低，而大多数蛋白质或类固醇激素的浓度不受影响；血清酶（例如ALT）、胆红素、电解质、总蛋白质、甘油三酯尿酸和尿素在室温可稳定56小时，但如果与细胞接触相同的时间段将会出现显著变化。
前期研究的解冻周期对一些分析物的影响如下：在-80℃储存的合并的EDTA血浆中钠经过100次冻融仍是稳定的；胆固醇、甘油三酯反复冻融20次是稳定的，超过20次则浓度降低。应注意，在一次冻融后，钠和胆固醇略有增加。
总之，除了PTH，常规的化合物、蛋白质和激素，在-80℃长达13个月的储存中表现出足够的稳定性。我们的研究结果表明使用儿科标本在-80°C储存不同时间段的参考区间的有效性。
编者按：本文发表在2012年，虽然研究较早，但是检测指标较多，研究方法值得借鉴。
作者：Brinc D et al【University of Toronto, Canada】
编译：孙士鹏【中国中医科学院广安门医院】
校审：孙峥嵘【中国医科大学附属盛京医院】
原文：【16233】
Long-term stability of biochemical markers in pediatric serum specimens stored at-80 °C: a CALIPER Substudy. Clin Biochem. 2012 Jul;45(10-11):816-26. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2012.03.029. Epub 2012 Apr 5.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22510430
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