研究蛋白-配体相互作用的NMR实验技术(1)

从本文开始，我会讲述一系列的NMR实验技术研究蛋白与配体的相互作用。

蛋白-配体相互作用的NMR实验技术，实际研究对象包括了蛋白-化合物小分子、蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-化合物小分子等体系，文章中常常用蛋白代表大分子，药物或者配体代表小分子，药物筛选是NMR应用的一大领域。下面这一系列文章主要介绍蛋白-配体相互作用的NMR技术，主要有化学位移、STD、NOE、扩散、化学交换、弛豫等实验技术，将在后文中一一介绍。

在讲述研究蛋白-配体相互作用的NMR技术之前，我们先简单说一下X射线晶体衍射、质谱与NMR在研究蛋白-配体相互作用的技术优劣。首先介绍X射线晶体衍射，X射线晶体衍射技术的优点是可以直接获得蛋白-配体复合物的完整的三维结构，可提供结合部位的结构信息和相互作用机理，可以研究比较大的蛋白质，其缺点是该技术研究的对象为晶体，而许多蛋白质-配体相互作用是在溶液状态下发生的，且不能结晶，其应用因而受限。质谱技术的优点为检测灵敏度高，需要样品量少，可以确定蛋白质-配体复合物的分子量及配体分子的数目，缺点为不能给出复合物的结果信息和相互作用的动力学信息。相对于这2个技术而已，NMR技术显著的优点为能在接近生理条件的溶液中检测蛋白质-复合物的三维结构、获得结合部位信息及动力学信息，缺点为只能检测比较小的蛋白，检测灵敏度较低，样品量需求较大，测试及分析周期长。

药物配体（L）与蛋白（P）的体系中会存在如下动态平衡过程：

PL ⇌ P + L，

蛋白与配体相互作用的强弱即亲和力可用离解常数K_d表示：

K_d=[P][L]/[PL]，

其中[P]、[L]、[PL]分别表示自由态蛋白、自由态配体和复合物复合物的浓度，离解常数K_d一般在纳摩尔级（nM）~毫摩尔级（mM），一般药物与靶分子之间的结合是特异性的高亲和性结合，复合物的离解常数K_d在纳摩尔级（nM），而在血浆中运输蛋白上除了较高亲和性结合位点外（K_d约mM），还有数十个低亲和性结合位点，K_d在毫摩尔级（mM）。K_d数值的大小影响着许多NMR参数及NMR谱的外观。K_d是表征蛋白-配体相互作用的重要参数之一。

蛋白与配体相互作用体系中的动态平衡过程可以用交换速率进行表征，在NMR领域，常常根据交换速率的不同而分为快交换、慢交换、中等交换等等。当交换速率远远小于配体与复合物化学位移之差时，为慢交换，此时可以观察到配体在自由态和结合体的共振谱峰；当交换速率远远大于配体与复合物化学位移之差时，为快交换，此时可以观察到配体的单一共振谱峰，化学位移为自由态和结合态的化学位移的加权平均；体系处于中等交换时，交换速率与位移之差相近，NMR谱峰严重增宽，此时获取配体蛋白质的相互作用信息困难得多。为了更好的研究蛋白-配体的相互作用，可以人为的调整一些实验参数，将研究体系简单化，如NMR研究者常常通过调节实验温度、pH值、盐浓度等等，将中等交换体系调整至快交换体系。

当化学交换相对于NMR时间尺度是快交换时，参数的观测值A_obs就是自由态参数A_f和结合态参数A_b的权重平均值：

        A_obs = X_b A_b+ X_f A_f                         

其中X_b和X_f分别代表结合态和自由态配体的摩尔分数。在快交换体系中，上述的核磁参数可以是弛豫速率、化学位移、自扩散系数等等。

当用NMR参数来研究药物－蛋白作用时，大分子和小分子信号都可以作为观测对象。在以大分子为观察对象的方法中，一般使用同位素标记的蛋白，通过检测NMR参数（如化学位移）的变化来得到结合位点的信息，且不受解离常数上限限制，但是要求蛋白同位素标记且不能过大。而以小分子为观察对象时，不需标记蛋白，且对蛋白分子大小没有限制，但是不能直接得到结合位点的结构信息。

NMR技术研究蛋白与药物相互作用主要解决以下问题：（1）药物是否发生了结合？（2）药物结合的强弱如何？（3）药物结合在哪儿？（4）药物是如何结合的？不同的NMR实验技术提供的信息有所不同，但都对第一个问题给出了明确的答复。

后续再具体讲解具体研究蛋白-配体相互作用的NMR实验技术。（近期实在太忙，更新有些慢）