免疫沉淀(IP)

------蛋白实验学习系列（九）

免疫沉淀步骤

免疫沉淀是一种纯化蛋白质的方法。将我们感兴趣的一种蛋白质的抗体与细胞提取液孵育，以使抗体和蛋白质在溶液中结合。然后用蛋白A/G 耦合的琼脂糖凝胶，从样品中将抗体/抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离出来。然后样品可以通过SDS-PAGE 分离出来进行Western blot 分析。

1.a 裂解缓冲液

理想的裂解液将保留蛋白质的天然构象，将抗体结合位点变性减到最少，同时从样本中释放足够量的蛋白质，以满足接下来的分析。非离子型去污剂比如NP - 40 和Triton X-100 比离子型去污剂如SDS 和脱氧胆酸钠要温和一些。其它可以影响到IP 成功的 因素包括盐浓度、二价阳离子浓度和pH 值。因此，要按如下范围优化这些变量（摘自Harlow and Lane，231 页，见参考部分67 页）：

• 0-1 M盐

• 0.1-2％ 去污剂，非离子型

• 0.01-0.5％ 去污剂，离子型

• 0-10 mM 二价阳离子

•      0-5mM EDTA

• pH 值：6-9

各种裂解液配方可以参考缓冲液部分。

变性裂解液

用于去污剂可溶性抗原，并且抗体可识别其天然构象。

1.RIPA（放射免疫沉淀法）缓冲液

比裂解液NP - 40 或Triton X -100 更能使蛋白质变性，RIPA 缓冲液含有离子型去污剂SDS 和脱氧胆酸钠作为活性成分，对裂解核膜进 行核内提取特别有用。RIPA 缓冲液可以降低背景，但同时可使某些蛋白变性，包括蛋白激酶。

2. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解液

使用含EDTA 和叠氮钠的PBS。有些可溶性蛋白不需要使用去污剂。对细胞使用此缓冲液并加上机械破损，例如反复通过注射器或 用Dounce 匀浆器匀浆。

3. 变性裂解液或用于不溶性抗原缓冲液的去污剂

天然蛋白质的抗原表位总是不容易靠近只识别变性蛋白质的抗体。当收集和裂解细胞时，用变性裂解液加热细胞。这个方法也可用于非离子型去污剂不能从细胞中提取的抗原。用DNase1 将有助于从染色质中提取蛋白质。

1.b 其他试剂

蛋白酶抑制剂

一旦裂解发生，水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样本在冰上或始终在4°C 存放以及一开始就往裂解液中加入适当抑制剂的话， 这些反应将可以大大减缓。混合（“鸡尾酒”）的蛋白酶和磷酸酶抑制剂已经商品化了。如果不使用混合的蛋白酶抑制剂，IP 实验 中最常用的两种蛋白酶抑制剂是PMSF（50μg/ml）和抑肽酶（1μg/ml）。磷酸酶和蛋白酶抑制剂的详细资料，请参阅我们的蛋白质 免疫印迹实验指南。所需的其他试剂：

• 无菌PBS pH 值7.4

• 无菌PBS-牛血清白蛋白1％ W/ V（过滤）

• TBST缓冲液

• 蛋白免疫印迹实验的加样/样品缓冲液

• 100 mM EDTA 贮备液：1.86g EDTA 溶解到40ml 水中。加氢氧化钠调整pH 至7.4。最后定容到50ml。

2. 裂解物制备

培养细胞的裂解

非变性：

1. 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的PBS洗涤细胞。

2. 吸干PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每107 细胞/ 100mm2 培养皿/150cm2培养瓶加1ml，每5x106 细胞/ 60mm2 培养皿/ 75cm2 培养瓶加0.5ml）。

3. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的EP 管中。

4. 4°C 持续振荡30 分钟。

5. 放入微型离心机4°C 离心。

您可能要根据细胞的类型更改离心力和时间。一个准则就是12,000rpm20 分钟，但是这必须由最终用户决定（如白细胞需要轻度 离心）。

6. 从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。

 

变性：

1. 加100μl 变性裂解液至0.5-2 × 107 个细胞中。

2. 用涡旋混合器最大速度剧烈震荡2-3 秒。将细胞悬液转入EP 管。<由于DNA 的释放，这步的溶液是粘性的>

3. 样品加热95°C 5 分钟变性。

4. 用0.9 ml 非变性裂解液稀释悬液,轻轻混合。（非变性裂解液中过量1％Triton X – 100 可以淬灭原来变性缓冲液中的SDS）。

5. 将裂解的悬液通过1ml注射器针头5-10 次，把DNA 打成片段。<重复机械断裂直到把粘度降低到可操作的程度。如果DNA 没有完全消化成片段，就会影响离心后分离上清和沉淀。>

6. 冰上孵育5 分钟。

7. 进行免疫沉淀反应。

 

组织裂解

1. 用干净器械解剖所要的组织，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。

2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮中“速冻”。样本在-80°C 储存备以后使用或放在冰上立即匀浆。

3. 对于约5mg 组织，向管中迅速加入约300μl 裂解液并用电动匀浆器均浆。

4. 裂解液冲洗刀片两次，每次300μl，然后4°C 持续振荡2 小时（将回旋振荡器放入冰箱）。

裂解液的体积根据组织总量来决定。蛋白提取物不宜过于稀释，以避免蛋白质损失，并尽量减少样品体积以便凝胶上样。最小浓度为0.1mg/ml；最佳浓度为1-5mg/ml。<注：如果样品需要变性，使用变性裂解液，然后参考上文变性程序执行步骤2-5>

5. 微型离心机4°C 12000rpm 离心20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。吸出上清液放入预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。

 

3. 裂解物的预清除程序

裂解物预清除可以帮助减少蛋白质非特异性结合到agarose (琼脂糖)或Sepharose beads (凝胶琼脂糖珠)。用无关抗体或血清 预清除，可去除蛋白质与免疫球蛋白的非特异结合。最终实验结果背景降低并且信噪比提高。但是，如果最后蛋白质是由免疫印迹实验检测，预清除未必必要，除非是污染蛋白质对目的蛋白质产生明显干扰。

1. 加入50μl 同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体（一些研究人员首选兔，参考Harlowand Lane，243 页） 到1ml 裂解物中，在冰上孵育1 小时。

2 加入100μl 珠浆。

3. 4°C 孵育10-30 分钟并轻轻搅拌。

4. 微型离心机14000g4°C 离心10 分钟。

5. 丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。 为了提高收率，珠子可用裂解液洗涤1 或2 次以上，并将上清收集在一起。

重要的是要确保尽可能多的去除正常血清，这是因为它会与特异抗体竞争靶抗原。为了检查这一点，可以做一个测试：用裂解缓冲液代替样品，如上进行所有预清除步骤。考马斯蓝染色的凝胶将显示上清液中血清IgG 是否被有效去除。如果血清没有得到充分去除，泳带将出现在50 和25 kDa 处，这是重链和轻链，它的存在可能导致一个弱的免疫沉淀反应。在预清除步骤，考虑降低血清量或增加与您的样品孵育的珠子数量。

 

4. 免疫沉淀

 

1. 在冰上预冷离心管中加入10-50μg 含推荐量抗体的细胞裂解物。具体数量将根据蛋白质的丰度和抗体与蛋白质的亲和力来选择。 通常在预实验中，通过增加抗体的量沉淀固定数量的蛋白质。

您可以查看抗体数据表获得建议抗体的浓度。以下供参考使用：

• 1-5μl 多克隆抗体血清

• 1μg 亲和纯化的多克隆抗体

• 0.2-1μl 腹水（单克隆抗体）

• 20-100μl 培养液上清（单克隆抗体）

2. 样品和抗体孵育的固定时间4°C 1-12 小时（过夜），最好轻轻振荡或旋转。孵育时间的长短取决于蛋白质的量和抗体的亲和特性。

3. 同时准备琼脂糖珠子。如果使用单克隆抗体，选择蛋白G 偶联琼脂糖珠子。如果使用多克隆抗体，蛋白A 偶联琼脂糖珠通常是 适合的（请参阅“选择蛋白珠”表9.5 下文）。如果买来的珠子是粉末，100mg 的珠子与1ml 0.1M PBS 孵育，洗1 小时后珠子膨 胀起来，然后离心，去除上清。加入1ml 含0.1％ BSA (牛血清白蛋白) PBS，混合1 小时，PBS 洗涤2 次。去除上清并加入400μl 含蛋白酶抑制剂的缓冲液（可与裂解液相同）就可以使用了。它可以在4°C 储存几天；在含0.02％ 叠氮钠的PBS 里会保存更长时间（使用当天用新鲜裂解液充分洗涤珠子）。您也可以购买事先膨胀好的珠子直接使用。<最好是用尖端切掉的移液吸头，以防破坏珠子。IgM抗体：不要使用蛋白A或蛋白G结合珠子。使用山羊抗小鼠 IgM（或多价Ig 或抗重链）的珠子。>

 

 

 

 

4. 浆料混合好，向每个样本中加入70-100μl。始终保持样品在冰上。珠子将倾向于粘着吸头，所以尽量减少珠子在吸管中运动并使用从尖端切断5mm 的吸头。

5. 裂解珠子混合液4°C 孵育4 小时并旋转振荡（最佳孵育时间可由预实验确定）。

6. 当孵育结束后，管子离心，去除上清液并用细胞裂解液洗涤珠子3 次（每次4°C 离心去除上清）。

7. 最后，去除最后一次上清并加入25-50μl 2×上样缓冲液。95-100°C 煮沸5 分钟，以变性蛋白质并将其与蛋白- A /G 珠子分离， 随后离心并保持上清含有蛋白质。然后，您可以冻存样品或进行SDS– PAGE 电泳。<使用上样缓冲液是最苛刻的洗脱方法，也将洗脱任何非共价结合的抗体和抗体片段，这将显示在免疫印迹胶中。抗原可用温和的甘氨酸梯度洗脱（高达1M），以减少抗体洗脱量。请同时参阅抗体交联琼脂糖凝胶分离程序>

5. 选择合适的微珠，汇总表

各种来源免疫球蛋白类型	蛋白A	蛋白G
人IgG1	+++	+++
人IgG2	+++	+++
人IgG3	-	+++
人IgG4	+++	+++
人IgM	用抗人IgM
人IgE	-	+
人IgA	-	+
小鼠IgG1	+	+++
小鼠IgG2a	+++	+++
小鼠IgG2b	++	++
小鼠IgG3	+	+
小鼠IgM	用抗小鼠IgM
大鼠IgG	-	+
大鼠IgG2a	-	+++
大鼠IgG2b	-	++
大鼠IgG2c	+	++
鸡全部亚型	-	++
奶牛全部亚型	++	+++
山羊所有亚型	-	++
豚鼠所有亚型	+++	++
仓鼠所有亚型	+	++
马所有亚型	++	+++
猪所有亚型	+	++
兔所有亚型	+++	++
绵羊所有亚	-	++

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + =Weak binding, - = No binding

 

参考资料

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. ColdSpring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Bonifacino,Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: JohnWiley, 2001.

6. 使抗体与微珠交联的步骤：

降低洗脱蛋白质溶液中污染的抗体数量： 为了使洗脱蛋白较少污染抗体，也为了更纯净蛋白质的制备和干净的免疫印迹实验，推荐将抗体与珠子交联。下面是一个实验程序举例（几个网站有关于这个程序有很多信息）。目标蛋白应该用温和的洗脱液洗脱，如甘氨酸缓冲液。

试剂：

交联试剂：

邻苯二甲酸二甲酯（DMP） 储液浓度13mg/ml

洗脱试剂：

1M 甘氨酸（加浓盐酸调整pH值至3）

稀释缓冲液：

PBS+ 1mg BSA 每1mlPBS

洗涤缓冲液：

含0.2M 三乙醇胺的PBS（每100ml 缓冲液中含3.04ml 三乙醇胺）

淬灭缓冲液：

含50mM 乙醇胺的PBS（311.7μl/100ml）

准备工作：

1. 珠子用PBS 洗2 次。最终浓度为50％ 珠浆。

2. PBS 混合均匀并4°C 旋转过夜。

交联：

1. 微量离心机（14000rpm1分钟）离心沉淀以洗涤珠颗粒。吸出PBS 上清液。

2. 1:1 比例加入稀释缓冲液，轻轻混合并4°C 旋转10 分钟。微型离心机离心并如上吸出/摒弃上清。

3.  按需要的浓度用抗体稀释缓冲液准备抗体溶液（参见抗体说明书的建议浓度）。1:1  比例将抗体加入，轻轻混合并4°C 旋转1 小时。

4. 离心并吸出/摒弃上清。

5. 1:1 的比例将稀释缓冲液加入，4°C 旋转5 分钟。离心并吸出/摒弃上清液。

6. 1:1 的比例将PBS加入，离心并吸出/摒弃上清液。

7. 交联：

用1ml 洗涤缓冲液，溶解1ml 准备好的13mg/ml DMP 储液。迅速漩涡震荡混合。1:1 的比例将DMP 溶液加入，室温（RT）旋转 30 分钟。<注意：DMP 在水溶液中不稳定。使用前快速配制。您需要确认DMP 在加入珠子前后的pH 值均在8-9 之间（在此pH 值范围以外，交联效率将大大降低）>

用洗涤缓冲液洗涤珠子（室温旋转5 分钟，离心并吸出/摒弃上清液）。 1:1 比例第二次加入DMP，室温旋转30 分钟，按之前方法洗涤。

1:1 比例第三次加入DMP，室温旋转30 分钟，按之前方法洗涤。

7. 淬灭和洗涤。

1:1比例加入淬灭缓冲液，室温旋转5 分钟，离心并吸出/摒弃上清液；重复该步骤。 用PBS 洗。

8. 去除多余的（未交联）抗体：

用1M 甘氨酸（pH3）洗涤。室温旋转10 分钟，离心并吸出/摒弃上清液；重复该步骤。 9. 存储洗涤。

用免疫沉淀缓冲液洗涤（通常是PBS+吐温）。室温旋转5 分钟。 洗三次，最后一次旋转后保存。珠子可以在4°C 储存几天。可以加入0.02 - 0.05％ 叠氮钠W/V 防止细菌生长。

免疫沉淀：

结合抗体的珠子现在可以进行如上常规IP 实验流程。 为了防止抗体与目标蛋白质一起洗脱，用温和的甘氨酸梯度洗脱（可到1M）。

 

7. 用IgM 抗体进行免疫沉淀

由于IgM 抗体的五聚体结构，所以很难用于免疫沉淀实验。IgM 抗体还不能很好地结合蛋白A 或蛋白G。有两种方法可供选择：

8.a 蛋白L 珠子

蛋白L是一个36kDa 的免疫球蛋白结合蛋白，可从大消化链球菌纯化。蛋白L 可以结合抗体的轻链（而蛋白A 和G 结合抗体重链 的Fc 段）。

蛋白L 比蛋白A 或G 结合抗体类型范围更广泛，因为重链的任何一部分都不参与结合相互作用。它能够结合所有抗体类型，包括 IgG、IgM、IgA、IgE 及IgD。单链可变区段（ScFv）和Fab 片段也能结合蛋白L。

蛋白L 仅限于结合那些含有kappa(κ) 轻链（即VL 功能区）的免疫球蛋白。在人类和小鼠中，以kappa (κ) 轻链为主。其余的免疫 球蛋白有lambda(λ) 轻链，它不结合蛋白L。此外，蛋白L 仅能有效结合kappa 轻链的某些亚型。例如，它结合人类VκI、VκIII 和 VκIV 亚型，但不结合VκII 亚型。对于小鼠，仅限于结合那些具有VκI 轻链的免疫球蛋白。

利用蛋白L有几个优势：

1. 蛋白L 不能结合牛、绵羊或山羊的抗体，因此非常适合从含牛血清的细胞培养液中纯化小鼠IgM。

2. 蛋白L 可以结合多种动物来源抗体的kappa 轻链而不干扰抗原结合位点，因此非常适用于用IgM 抗体的免疫沉淀。

3. 它能结合所有类别的免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA、IgE 及IgD），因此对IgM 纯化特别有用，因为IgM 不能用蛋白A 或G 纯化。

8.b 使用结合了抗IgM 的IgG 的蛋白A 或G 珠子

此方法涉及抗IgM 抗体的IgG 耦联蛋白A 或G 珠子（方法见下文）。这些珠子就可以在常规免疫共沉淀程序中使用IgM 抗体。通过 结合抗-IgM 抗体，IgM 可以间接结合珠子。

下面的过程介绍了用DMP 如何把抗IgM 抗体与蛋白A 或G 涂层的珠子耦合：试剂：

• 200mM 硼酸盐缓冲液+ 3M 氯化钠pH 值9.0

• 含20mM（DMP）的200mM 硼酸缓冲液+ 3M 氯化钠，pH值9.0

• 200mM 乙醇胺pH值8.0（乙醇胺储液1:80 稀释）

• 磷酸盐缓冲液（PBS）

• PBS+ 0.1％ 叠氮化钠

• 200mM 甘氨酸pH值2.5

• 蛋白A 或G 珠子（Sepharose）

方法：

我们建议每ml 湿珠子使用每2mg 抗体（使用适当的抗体/蛋白A 或G 结合物）。

1. 使用前1 小时将250mg 蛋白A 或GSepharose（珠子）加入2ml PBS+0.1％ 叠氮钠。这使得珠子膨胀。

2. 将珠子与适当浓度的抗体室温混合2 小时（旋转或滚动）。

3. 2500rpm 离心5 分钟。

4. 10 倍体积200mM硼酸缓冲液+ 3M 氯化钠洗珠子两次。

5. 20mM DMP 重悬珠子。

6. 室温旋转/振荡珠子30 分钟。

7. 将珠子2500rpm 离心5 分钟。

8. 200mM 硼酸盐缓冲液+ 3M 氯化钠洗珠子2 次。

9. 20mM 乙醇胺洗珠子1 次。这步终止耦合反应。

10. 20mM 乙醇胺重悬珠子并室温旋转2 小时。

11. 将珠子2500rpm 离心5 分钟。

12. PBS 洗珠子2 次。

13. 200mM 甘氨酸洗珠子2 次。

14. PBS 洗珠子2 次。

15. 珠子可以4°C 储存在PBS + 0.1％ 叠氮钠溶液里（PBS︰珠=1:1）。

16. 这些珠子可用于IgM 抗体的免疫沉淀实验。从这里就可以按照我们前面描述的免疫沉淀实验方法继续进行免疫沉淀程序了。

 

9. 免疫沉淀疑难解答提示

高背景

去污剂不溶性蛋白有残留

离心后立即去除上清。沉淀中留有不溶性蛋白质，如果再次有悬浮发生，再次离心。

洗涤不充分

盖上管盖离心前反复颠倒几次。

非特异性蛋白质与珠子结合。

珠子用BSA 预封闭不充分。确保牛血清白蛋白（组分V）新鲜，新鲜珠子与含1％ 牛血清白蛋白的PBS 孵育1 小时，使用前PBS 洗 3-4 次。

使用的抗体特异性不够。

使用亲和纯化的抗体，最好预先吸收。

使用太多抗体导致非特异性结合

检查推荐抗体用量。尝试使用更少的抗体。

细胞裂解液中含有太多的细胞或太多蛋白质，导致洗脱液中有很多额外的（假阳性）蛋白质。

减少细胞数量/裂解液使用。我们推荐使用10-500μg细胞裂解液。

蛋白与抗体非特异性结合

如果有很多非特异结合的蛋白质，可以尝试减少上样珠子的样本数量。您还可以在开始免疫沉淀实验之前预先孵育珠子和准备好的裂解液（请参阅实验方案）来预清除裂解液。这应该清除裂解液内任何与珠子非特异结合的蛋白质。一些研究人员也使用同种来源 和相同免疫球蛋白亚类的无关抗体来预清除裂解液。

免疫沉淀实验时抗原降解

确保样品裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂。

大量抗体被洗脱

太多抗体与目标蛋白质洗脱

尝试减少抗体用量。免疫沉淀前将抗体与珠子交联，并使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱将大大减少抗体洗脱量。

没有检测到目的蛋白洗脱

所用样品中不表达或低水平表达目标蛋白质

检查目标蛋白质的表达谱，以确保它会在您样品的细胞表达。如果有目标蛋白低水平表达，增加裂解液的使用量。但是，这可能导致增加非特异性结合，所以开始免疫沉淀程序之前最好预先清除裂解液。

没有足够的抗体捕获目标蛋白

检查抗体的建议使用量。抗体浓度可能需要增加。

目标蛋白没有从珠子上洗脱

确保您使用的洗脱缓冲液是正确的，并且是洗脱蛋白质所需的正确强度和pH值。

抗体没有结合免疫吸附磁珠

确保您使用的珠子与抗体亚型匹配。

使用的裂解液不正确。

检查说明书，看看抗体是否能检测变性蛋白质或天然蛋白质，并确保使用正确的裂解液。

更多精彩内容，请扫描下面二维码关注@慧耕达生物公众号