实验分享|人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究

人瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）是一种无包膜双链DNA病毒，能引起子宫颈癌、生殖器疣等肿瘤疾病或癌症。宫颈癌在妇女中发生率位列第二，在发展中国家发生率明显高于发达国家。统计表明，我国每年新增宫颈癌患者约15万人左右，且年轻患者比例上升明显。

国外已上市或获批产品均利用L1自身形成VLP结构的原理进行研制。研究表明，接种氨基酸序列较为保守的L2蛋白能诱导产生涵盖多种血清型HPV的保护力，但L2蛋白或L2多肽本身免疫原性较低。重组的乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B virus core antigen，HBcAg或HBc)可在大肠杆菌中高效表达，易纯化，并能自身组装形成VLP。构建合适的HBc与目标抗原融合蛋白，将目标抗原展示在HBc形成的VLP表面，能有效地提高目标抗原的免疫原性。

本研究将两段16型人瘤病毒L2抗原多肽(13-47位与65-81位氨基酸) 偶联后作为抗原片段插入到HBc蛋白中，在大肠杆菌中表达融合蛋白并自动组装成VLP。研究结果显示，HBc-L2病毒样颗粒显著增强了L2多肽抗原的免疫原性，所获得的小鼠血清具有中和16型与18型HPV的能力。此项研究为开发广谱、低成本的宫颈癌疫苗提供了一个新途径。

本研究中采用的HBc蛋白为截短蛋白，在其178位置上插入L2蛋白氨基酸片段。将扩增片段经双酶切后回收目的基因，与载体质粒pET9a连接。连接产物转化后挑取阳性克隆，经LB培养基扩增后提取质粒进行酶切鉴定，将获得的HBc-L2融合基因的表达质粒命名为pET9a-HBc-L2。以该表达质粒为模板，PCR扩增L2抗原编码片段，经连接、转化等构建表达质粒pGST- L2作对照。

将表达质粒pET9a-HBc-L2转化、扩增纯化后获得菌种。取冻存菌种扩大培养并诱导；将离心菌体用TGE buffer（50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM Nacl，5%甘油）重悬；将超声后离心上清硫铵沉淀，沉淀经TGE buffer重悬并用0.22μm滤膜过滤，并用100kDa膜包超滤浓缩。用CL-4B凝胶对浓缩液进一步分离纯化，收集目的蛋白。

将表达质粒pGST-L2转化BL21（DE3）获得GST-L2表达菌株，扩大培养、纯化后制备GST-L2对照样品。

采用分子筛高效液相色谱（SEC-HPLC）及HPLC-多角度激光光散射（MALS）联用技术鉴定蛋白纯度和VLP颗粒大小。委托中国科学院生物物理研究所蛋白质实验平台生物成像中心采用透射电子显微镜进行VLP形态观察。

每批HBc-L2 VLP样品设20、10、5、1μg/只四个浓度组，每组10只；GST-L2为20、10μg/只，每组7只；阴性对照10只小鼠，注射生理盐水。所有组别均在0天皮下注射500μL对应样品，第14天、28天分别进行第二、三次免疫，免疫第28、42天采血，将分离血清-20℃暂存。

用GST-L2蛋白溶液包被酶标板，间接ELISA检测HBc-L2免疫后获得的血清。检测GST-L2融合蛋白免疫后获得的血清时，采用HBc-L2包被酶标版。

待测血清（HBc-L2三免血清）灭活后按1:15、1:30、1:60、1:120进行系列稀释，阴性血清按1:15稀释。PsV16和PsV18进行1:200和 1:100稀释。假病毒和血清按1:1进行混合，4℃共孵育60min，再将混合液加入已培养6h的96孔293FT细胞板中继续培养[14]。72h培养结束后观察EGFP荧光表达。观察结束后，将细胞消化并转移至新的96孔板，进行流式细胞术分析。

组间差异选用t检验进行分析，P< 0.05为差异具有显著性。

如图1A&1B所示，构建的表达载体pET 9a-HBc-L2与GST-L2双酶切后的条带均与预期质粒大小及基因片段一致。

 图1：表达载体双酶切鉴定图

A: Digestion of pET9a-HBc-L2 with BamH and NdeI;

B: Digestion of pGST-L2 with AsiSI and PmeI

电泳结果（图2）显示，诱导后上清和沉淀中均出现约为24kDa的蛋白，与HBc-L2融合蛋白的理论分子量相符，表明HBc-L2融合基因的产物主要为可溶性蛋白，少部分形成包涵体。

图2：HBc-L2诱导表达鉴定

Note: M.Marker; Lane 1.Soluble fraction of cell lysate;

Lane 2. Insoluble fraction of cell lysate

对破碎上清进行硫铵沉淀（图3A）、复溶并超滤浓缩，CL-4B分子筛层析纯化，外水体积收集蛋白峰（图3B，峰1）；所获样品进行蛋白电泳，结果如图3C，样品中目的蛋白纯度大于80%，主要杂质为分子量约30kDa的蛋白。

图3：HBc-L2融合蛋白纯化

A: SDS-PAGE analysis of samples before and after ammonia sulfate precipitation;

B: Purification of HBc-L2 by CL-4B gel filtration chromatography;

C: SDS-PAGE analysis of samples before and after CL-4B gel filtration

Note: 3A M. Marker; 1. Cell lysate before induction; 2. Cell lysate after induction; 3. supernatant after Ammonium sulfate precipitation;

4. TGE suspension of Ammonium sulfate precipitation; 5. Precipitate after centrifugation;

6. Supernatant after centrifugation

3C M.Marker；1. HBc-L2 before CL-4B gel filtration; 2.HBc-L2 after CL-4B gel filtration

HBc-L2分子量约为24 kDa，但出峰时间远早于66 kDa的BSA（出峰时间约23min），表明该蛋白并不以单体形式存在，而是组装成大分子结构（图4A）；SEC-HPLC-MALS结果进一步表明，获得的HBc-L2融合蛋白分子量大，且分布集中、结构均一（图4B）。

图4：HBc-L2融合蛋白分子大小分析

A: SEC-HPLC analysis of HBc-L2; B: SEC-HPLC-MALS analysis of HBc-L2

HBc-L2经投射电子显微镜观察（图5），镜下可见大量均一分布、直径约为30nm的圆形颗粒，与报道的HBc病毒样颗粒相符，表明融合蛋白HBc-L2能有效包装成大分子病毒样颗粒。

图5：HBc-L2 病毒样颗粒电子透镜鉴定

A: HBc-L2-1; B: HBc-L2-2

二次免疫后，血清抗L2抗体效价已超过104（图6A）；三次免疫后，各剂量组抗体滴度较二免略有增加（图6B），但无显著差异（P>0.05），不同批次样品免疫原性差异不显著（P>0.05），表明HBc-L2具有良好的免疫原性，二次免疫即可产生高滴度抗体，且不同批次样品的结构和免疫原性较一致。

高剂量（10和20μg）GST-L2蛋白三次免疫后，血清中抗L2的抗体效价分别为102或103，远低于HBc-L2的免疫效果（图6C）。

图6血清中抗L2抗体滴度检测

A: After two injections with HBc-L2; B: After three injections with HBc-L2;

C: After three injections with GST-L2

阴性血清（1:15倍稀释）对假病毒感染效力无影响。PsV16与PsV18感染后细胞表达荧光。与假病毒共孵育后的待检血清中（1:15倍稀释），假病毒的感染能力明显被抑制，镜下仅能找到极少表达荧光的细胞（图7）。共孵育的免疫血清稀释倍数增加后，也对两个假病毒的感染效力有不同程度的抑制（结果未显示）。

图7：HPV假病毒中和试验荧光采集

细胞消化转移后进行流式分析，结果显示阴性血清对假病毒无中和作用。对PsV16与PsV18，随着病毒稀释倍数增加，荧光细胞感染比例逐渐下降。

综合显微镜观察和流式细胞仪分析结果，HBc-L2免疫小鼠后获得的血清具有中和16型HPV的能力，并对18型也有较强交叉中和活性。

国外已上市疫苗均采用主要衣壳蛋白L1作为抗原主要成分，但L1蛋白具有较强型特异性，不能覆盖其他血清型的病毒，需分别制备不同型的疫苗组分以形成多价制剂，制备工艺复杂，生产成本高。而目前约80%的宫颈癌病例发生于发展中国家，昂贵的HPV疫苗无法使这些地区的人群完全受益。

研究表明，次要衣壳蛋白L2虽不属于维持病毒结构的主要蛋白，在病毒表面含量相对较少，但能与次级病毒受体结合从而促进病毒基因组从胞内体向核内转移，与瘤病毒感染有重要联系。但L2免疫原性相对较弱，极大限制了基于L2抗原的疫苗开发。本研究中，我们将16型HPVL2蛋白N-端抗原插入到HBc蛋白中，在大肠杆菌中表达获得HBc-L2融合蛋白，并证明经纯化的HBc-L2自动组装形成了VLP结构。由于HBc-L2可在细菌中高效表达，VLP纯化过程简单且收率高，生产成本将能得到有效控制。在小鼠试验中，免疫原性远高于不能形成VLP结构的GST-L2融合蛋白。因此，将L2抗原多肽展示在HBc形成的VLP表面上能有效增强L2抗原的免疫原性。通过假病毒中和试验，进一步证实了HBc-L2 VLP免疫后血清不仅显著中和16型HPV的感染效力，对18型HPV也有较强中和活性。

综上，HBc-L2 VLP可能成为一个生产成本低，且对不同血清型有广泛覆盖率的新型HPV疫苗。

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