你知道和蛋白表达相关的操作问题是如何解决的吗?

2023-05-10 14:56:27

蛋白表达”疑难解惑第一弹

Q1

用于蛋白表达的常见启动子有哪些?


请浏览下表来了解常用的组成型和诱导型启动子。

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Q2

Shine-Dalgarno序列(也称为核糖体结合位点(RBS))与Kozak保守序列之间的区别是什么?


核糖体结合位点(RBS)是mRNA分子5'(上游)的区段,能够结合核糖体正确定位至翻译启始位点。RBS能够控制mRNA翻译启始的准确度和效率。


在原核mRNA中,RBS位于起始密码子(即第一个AUG)上游7个核苷酸处。本序列也称为Shine-Dalgarno序列,是由位于AUG起始密码子5'端的多鸟苷酸序列AGGAGG所组成的。由于这一序列能够与30S核糖体亚基中16S rRNA的3'端实现互补,因此该信使RNA能够与核糖体高效结合。Shine-Dalgarno序列是必需的。


真核生物中的蛋白合成过程与这一模型不同。mRNA的5'端具有一个经修饰的化学结构(“帽”结构),能够被核糖体所识别,后者随之与mRNA相结合并沿着mRNA移动(“扫描”)直至找到第一个AUG密码子。碱基的特征模式(称为“Kozak序列”)有时在该密码子的周围被发现,以使人想起Shine-Dalgarno序列的方式帮助正确定位mRNA,但不与核糖体RNA形成碱基配对。


因此,Kozak序列并非是核糖体结合位点,而是一个翻译启始增强子。保守的Kozak序列为G/ANNAUGG,其中的AUG表示起始密码子。-3位点的一个嘌呤(A/G)碱基具有显性效应;如果-3位点是一个嘧啶(C/T)碱基,则翻译进程会对-1,-2和+4位点的改变更为敏感。当-3位点从嘌呤变为嘧啶时,表达水平可能降低达95%以上。+4位点对于表达水平的影响较低,只发现有50%左右的降低影响。注意:酵母不遵循这一规则。果蝇中优化的Kozak序列会有些许的不同(C/AAAA/CAUG)。


Q3

我发现赛默飞所提供的某些克隆载体含有表位标签,如HIS或V5。这些标签是做什么用的,如果我希望使用这些标签,我应做哪些考虑?


通常情况下,引入表位标签是为了与您的目的基因进行融合,来使目的基因更易检测或快速纯化。表位标签可融合于目的基因的N-端或C-端。使用表位标签时有一些需要考虑的事项:


1. N-端标签可能含有蛋白酶切割位点
2. N-端标签中含有RBS/Kozak序列
3. 分泌信号肽一般位于N-端,并能够在高尔基体加工过程中自动被切割
4. 如果目的基因中含有天然分泌信号,则需将其替换
5. 当蛋白的C-端对于其功能至关重要时,请选用N-端标签
6. 当使用N-端标签时,请确保目的基因的末端含有终止密码子
7. 如果使用N-端标签,请确保目的基因与标签处于同一阅读框中
8. 当N-端对于蛋白功能至关重要时,或蛋白功能域未经鉴定时,请选择使用C-端标签
9. 在与C-端标签融合时,请确保去除了目的蛋白的终止密码子;终止密码子应位于C-端标签末端
10.在使用C-端标签时,请确保在目的基因的起始部位包含起始密码子(ATG)和RBS/Kozak序列(如果需要的话)
11.如需引入一个C-端标签,请确保该标签与目的基因处于同一阅读框中


Q4

我应选择何种表达系统?大肠杆菌,酵母,昆虫还是哺乳动物?


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Q5

你们能列举一下不同表达系统之间的优缺点吗?



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Q6

我的蛋白不表达。你们能提供一些建议吗?

这里列举了一些可能导致蛋白不表达的最常见原因/解决办法:


低转染效率:开展稳转筛选或采用能够检测单个细胞的技术手段,优化您的转染操作。您也可尝试通过替换启动子来提高表达水平。


所采用的检测手段可能无法有效检测细胞内的表达水平:优化检测方案或寻找更为灵敏的方法。


蛋白可能被截短或降解:通过Northern杂交进行检查。


可能存在时间-进程问题:蛋白表达水平可能基于蛋白天然属性而随时间变化而变化;因此推荐检测不同时间点的蛋白表达水平。


可能存在溶解性问题:在大肠杆菌中过表达蛋白可能会形成包涵体,后者在标准的SDS-PAGE样品缓冲液和煮沸条件下不可溶;如需检查不可溶成份,可能需要使用6-8M的尿素和超声处理。


可能存在克隆问题:通过限制性酶切和/或测序来验证克隆的准确性;确保其中存在正确的表达元件。


 

Q7

我挑选的具有抗生素抗性的克隆却未表达目的基因。我该如何处理?




这里列举了一些具有抗生素抗性的克隆不表达目的基因最为常见的可能原因/解决方案:


所用检测法可能不适当或不够灵敏。


筛选到的克隆数不够。


稳转筛选中所用的抗生素浓度不当(请确保获得了准确的致死曲线);对于稳转筛选的操作而言,您目的基因的整合位点十分重要,不同的整合位点会导致不同的表达水平。


基因产物的表达(即使低水平)可能与该细胞系的生长不相容(即您的目的基因为毒性基因)。因此,请尝试使用诱导表达系统。


如果您已经使用了诱导表达系统,请确保蛋白表达未发生泄漏情况。


阴性克隆可能是由于目的基因表达的关键载体位点处优先发生了线性化。


Q8

未观察到目的分泌蛋白的表达,我该如何处理?


同时检查细胞裂解产物和培养基中是否存在目的蛋白。尽管带有分泌信号序列的大多数蛋白会被分泌,但并非所有蛋白都如此。



Q9

我的表达蛋白在功能学分析中没有活性。怎么会发生此种情况?


目的蛋白可能缺乏功能活性所需的翻译后修饰。


举例来说,绒毛膜促性腺激素就需要哺乳动物的糖基化修饰才具有活性。尽管昆虫细胞能提供糖基化修饰,但它们无法提供绒毛膜促性腺激素活性所需的特定糖基化。


???


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