Ä爱纯派 如何证明蛋白相互作用

2023-05-10 14:56:27







纯化应用专家

您身边的

 Ä
爱纯
派


发送问题至akta.club@ge.com
48小时（工作时间）回复


不论是在科研工作还是新药研发中，我们常常需要对蛋白相互作用或者说蛋白复合物的存在进行验证，比如：寻找信号通路中的上下游蛋白、研究蛋白复合物的功能机理、探寻生物药的作用靶点和机制等，小编今天就为大家总结了一些蛋白复合物或蛋白相互作用的验证方法，希望能帮助大家从不同的角度实现探究。

定性证明
1
免疫（共）沉淀: 快速验证法

又称IP、Co-IP、pull-down。作为验证蛋白相互作用的经典方式，其原理是利用抗体对抗原特异性的捕获，进而用protein A或G捕获抗体，进而通过抗体捕获对应的目标抗原，再通过检测目标抗原及其复合物中的蛋白，来验证相互作用是否存在。听起来非常简单，但做过这个实验的朋友应该会觉得它还是有一定难度的，需要注意的细节也比较多。为此，小编也精心制作了《免疫共沉淀操作指南》，可通过扫描如下二维码获取。同时，我们还推出GammaBind Plus Sepharose填料：具有广泛种属的抗体亲和力，同时只结合抗体的Fc端，利于Fab端自由且充分的捕获抗原，助力免疫（共）沉淀获得好结果。


2
凝胶过滤: 不仅可以验证还可以制备

又称分子筛或体积排阻层析。这个是多数做纯化的老师最熟悉的实验了。其原理也非常简单：根据蛋白或其他生物分子的大小对其加以区分，大蛋白会先出峰，小蛋白会后出峰。那么如果两个蛋白之间存在直接相互作用，其在凝胶过滤上的出峰理论上会提前，如上图所示[1]，以此来验证其是否存在相互作用或者说能否形成复合物。由于该方法处理量比较大，还可以在验证的同时进行蛋白复合物的制备。同时，基于此原理，凝胶过滤还可以用来对未知蛋白进行分子量测定或者对复杂样品进行分子量分布的研究。


定量证明
1
Biacore SPR技术: 定量证明

上面两种方法都是定性证明，如果要进行定量验证，比如要确定其结合速率常数/解离速率常数（Ka/Kd），那么就需要用到更精确的手段，如Biacore SPR分析，他可以提供最全面且精准的相互作用分析数据，除了验证相互作用是否存在，还有结合力的强弱，结合的整个动态过程，复合物的组装顺序，分子结合热动力学，活性浓度检测等等。了解更多Biacore应用请关注本公众号中的往期分享。

更多辅证
1
结构分析: 获得详细信息

想要看到蛋白复合物之间的具体结合情况，最好的方式就是对该复合物进行结构解析。以高福教授的这篇文章[1]为例：正是通过结构解析与一些其他技术手段的配合，更好的证明了nivolumab阻断PD-1/PD-L1相互作用模式。欲了解该文中蛋白表达与纯化方式，请扫描本文下方二维码。


2
交联法: 鉴定可能结合位点

某些试剂会特异性的与特定氨基酸发生交联反应，利用这一原理加上特定氨基酸的突变，可以证明和预测哪些位点是可能的结合位点。说到这里，我们也可以看到，突变的方法在验证蛋白相互作用具体位点的实验里是非常常见的一种反向证明手段。

3
免疫荧光共定位: 
看到体内或细胞内真实情况

很多相互作用的发现伊始，可能是基于免疫荧光中观察到了某几个蛋白的共定位。反之，这也是一种证明相互作用的方法，而且其优势是能看到该复合物或相互作用发生的细胞中的准确位置，比如是在核内？线粒体？还是膜上？等等，参考如下[2]：


以上就是本期为大家从不同的学科角度总结的蛋白相互作用或者说蛋白复合物的验证方式，希望能给大家的实验带来些许帮助。同时，如您有更好的分析和证明方法，也欢迎通过留言与我们分享。

当你孤单你会想起谁？
父母？挚友？或者爱纯派？…
相关文献

[1] Tan, S., H. Zhang, et al. (2017). "An unexpected N-terminal loop in PD-1 dominates binding by nivolumab." Nat Commun 8: 14369.
[2] Mario Gimona, et al. (2017). "Calponin Repeats Regulate Actin Filament Stability and Formation of Podosomes in Smooth Muscle Cells." Molecular Biology of the Cell Vol. 14, 2482–2491, June 2003 8: 14369.

GE免疫（共）沉淀操作指南：

高福教授文章中蛋白表达纯化方式：


了解更多层析纯化方式请关注爱纯派往期分享哦~


大家在看
友情链接

Copyright © 2023 All Rights Reserved 版权所有 福建水产设备联盟