【邦士富 · 技术分享】秸秆发酵饲料高产蛋白酵母菌株分离和筛选

1.1 试验材料

牛瘤胃食糜样本采自南宁市某屠宰场，采样后装入封口袋中密封，及时送回试验室并置于4℃冰箱中保存。麦芽汁粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、琼脂和纯净水等从市场购置，玉米秸秆粉从农户处收购，烘干粉碎。

1.2 试验方法

1.2.1 牛瘤胃食糜中酵母菌增菌培养及分离纯化

称取新鲜牛瘤胃食糜样品1.0g，均化后加入0.85%生理盐水100mL，在180r/min、30℃的恒温摇床中培养30min。然后用平板稀释法在麦芽汁琼脂培养基上接种增菌培养液，30℃培养3d，挑取单菌落进一步纯化培养2～3次，将纯化后得到的酵母菌单菌落编号接种于麦芽汁琼脂斜面上，30℃恒温培养2～3d。

1.2.2 酵母菌生理生化鉴定

在麦芽汁粉培养基上接种纯化酵母菌菌株，30℃恒温培养48h后观察菌落特征、细胞形态及子囊孢子、菌丝、掷孢子的形成情况，并进行葡萄糖发酵试验、乙醇同化试验、KNO₃同化试验和类淀粉化合物测定。

1.2.3 优化酵母菌培养条件

采用正交试验L₁₆(4⁴)对酵母菌培养条件(温度、初始pH、接菌量和装液量)进行4个水平检测(表1)，优化培养条件，并筛选出生长性能较好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸秆粉培养基，在不同条件下培养48h，测定其生物量。生物量测定：取1.0ml试验生长菌液，用蒸馏水进行40倍稀释，以接种前培养基同样稀释40倍为空白，分光光度计测定660nm处的OD。

2.1 分离酵母菌的形态特征及生理生化鉴定结果

共分离出10株菌落形态和细胞特征较明显的疑似酵母菌株，分别编号为x1～x10。在高倍显微镜下观察菌落形态和细胞特征，然后根据《常见细菌系统鉴定手册》初步判定细菌属。

由表2和表3可看出，x1号菌株呈乳白色，无醭膜，细胞形态为卵圆形，为多端芽殖，有菌丝生成，芽殖繁殖，无掷孢子，可发酵葡萄糖，KNO3同化试验呈阳性，类淀粉物质生成和乙醇同化试验均为阴性，故初步判定为酒香酵母属。

x2号菌株呈乳白色，细胞形态为卵圆形，仅一端芽殖，有菌丝形成，芽殖繁殖，葡萄糖发酵试验、类淀粉物质生成试验和KNO₃同化试验均呈阴性，乙醇同化试验呈阳性，故初步判定为瓶形酵母属。

x3号和x5号菌株的颜色均为白色，细胞形态呈圆形，多端芽殖，无菌丝生成，芽殖繁殖，葡萄糖发酵试验、类淀粉物质生成试验和乙醇同化试验均呈阴性，根据《常见细菌系统鉴定手册》可初步判定这两株菌株为卵孢酵母属。

x4号菌株呈乳白色，细胞形态圆形，两端芽殖，有菌丝生成，芽殖繁殖，有子囊内含有1～2个帽形孢子，类淀粉物质生成试验、KNO₃同化试验和乙醇同化试验均呈阳性，葡萄糖发酵试验呈阴性，故初步判定为裂芽酵母属。

x6号菌株呈乳白色，细胞形态卵圆形，多端芽殖，无菌丝生成，芽殖繁殖，有掷孢子生成并伴有锁状联合，葡萄糖发酵试验和KNO₃同化试验呈阳性，类淀粉物质生成试验和乙醇同化试验呈阴性，故初步判定为锁合掷孢酵母属。

x7～x10号菌株颜色呈白色或乳白色，细胞形态圆形，有假菌丝，且可形成真菌丝，芽殖繁殖，无有性繁殖，类淀粉物质生成试验呈阴性，根据《常见细菌系统鉴定手册》初步判定x7～x10号菌株为假丝酵母属。

2.2 培养条件优化筛选结果

正交试验L₁₆(⁴⁴)结果表明，x1～x10号菌株的最佳培养组合均为A2B1C4D3(表4)，即在温度32℃、初始pH5.5、接种量12.0%、装液量100ml的条件下，各分离酵母菌的生物产量最高。在10株分离酵母菌株中，生物产量最高的4株分别是x9号(OD_660nm=1.6220)、x1号(OD_660nm=1.5765)、x10号(OD_660nm=1.5738)和x5号(OD_660nm=1.5709)。

2.3 生长曲线测定结果

将优化培养筛选出的4株分离酵母菌菌株按照其最佳培养条件摇床(180r/min)培养48h，测定各菌株的生长曲线。由附图可知，x9号和x1号菌株适的应期较短，在2h后进入对数生长期，生长速度较快，8h后达稳定期；x10号和x5号菌株的适应期较长，4h后进入对数生长期，12h后进入稳定期。

酵母菌是单细胞真菌，具有典型的真核细胞结构，在自然界广泛存在。酵母细胞中蛋白质占细胞干重的32～75%，糖类物质占细胞干重的27～63%。酵母细胞中还富含维生素、多种消化酶和未知的生长因子，因此在食品、医疗保健、饲料、酿酒、生物工程等行业中得到广泛应用。经发酵菌发酵过的饲料，含有更多的活性益生菌菌体、各种酶、各级代谢产物、多种维生素、活性小肽、氨基酸、抑菌物质等，既改善动物饲料的品质和适口性，消化吸收率明显提高，还具有维持动物肠道菌群平衡、促进动物生长、提高动物免疫力等作用。但目前市场上可用于饲料发酵的酵母菌产品较少，且不同酵母菌的培养条件也不同。

本研究利用培养基平板划线法从牛瘤胃食糜样本中分离获得10株菌落形态和细胞特征较明显的疑似酵母菌株，经正交试验L16(44)优化其培养条件，发现在温度32℃、初始pH5.5、接种量12.0%、装液量100ml的条件下，各分离酵母菌的生物产量最高，与邓露芳等的研究结果基本一致。在10株分离酵母菌株中，生物产量最高的4株分别是x9号、x1号、x10号和x5号。其中，x9号和x1号菌株适的应期较短，在2h后即进入对数生长期，8h后达稳定期；x10号和x5号菌株的适应期较长，4h后进入对数生长期，12h后进入稳定期。综合酵母菌株的培养条件及生长曲线测定结果，确定假丝酵母属菌株最适宜作为青贮用高产蛋白酵母菌。