【文峰聊CNS】染色体不稳定促进肿瘤转移

染色体不稳定性是癌症的一个特点，它是在有丝分裂过程中染色体分离持续发生错误所导致的。现已证实染色体不稳定性是肿瘤进化的一个主要驱动因素，但其在肿瘤转移中是否有作用仍未了解清楚。今天给大家带来Nature上的一篇Article——《Chromosomal instability drives metastasis through acytosolic DNA response》，即“染色体不稳定性通过一种细胞质DNA反应驱动肿瘤转移”。文中作者发现，染色体不稳定性能够造成和维持肿瘤细胞对细胞质DNA（cytosolicDNA）产生一种自主反应状态，最终促进肿瘤转移。染色体错误分离使得大量微核破裂，基因组DNA溢出至细胞质，导致cGAS-STING（cyclicGMP-AMP synthase–stimulatorof interferon genes）细胞质DNA感受通路及下游非经典NF-κB（noncanonical NF-κB）信号通路激活。抑制染色体不稳定性基因可以显著延缓转移（甚至是在高度异倍体肿瘤模型中），然而持续染色体错误分离则会以一种依赖STING的方式，促进细胞侵袭和转移。通过“推翻”细胞质DNA本该产生的致死性上皮反应，染色体不稳定肿瘤细胞“拉拢”固有免疫通路进行远处转移。

 

过表达驱动蛋白-13蛋白家族的KIF2B或KIF2C（MCAK）可以抑制CIN

染色体不稳定性（CIN，Chromosomal instability）和肿瘤转移有关，但它是否驱动转移进程仍不清除。染色体不稳定细胞在染色体分裂后期发生染色体错误分离，不失为靶向CIN及探究其对肿瘤转移特殊作用的一个突破口。通过过表达非动力微管解聚驱动蛋白-13家族的蛋白（thenon-motilemicrotubule-depolymerizing kinesin-13 family proteins）KIF2B或KIF2C（也成MCAK），着丝粒处附着于染色体的微管去稳定化，能够直接抑制CIN。过表达KIF2B或MCAK的细胞能继续分裂增殖为异倍体核型，但其染色体稳定。因此，这种方法能用来对CIN进行实验性探究，CIN是由染色体持续错误分离决定的，而不是异倍体（染色体数量异常）。

 

人转移瘤CIN增加

首先，为了证明CIN和人肿瘤转移相关，作者用加权基因组完整性指数（wGII，weighted-genomicintegrity index）替代CIN，对79组配对的原发肿瘤和脑转移瘤进行比较。转移瘤比原发肿瘤的wGII更高（Fig.1a）。

然后，在染色体易位的Mitelman数据库中，对原发乳腺肿瘤和转移瘤进行核型分析，发现原发肿瘤中多为近二倍体（2n）核型。相反，转移瘤中的细胞则多为近三倍体（3n）核型，并且结构性染色体异常或数量性染色体异常是原发肿瘤的两倍。核型落在二倍体至四倍体范围之间的肿瘤样本染色体异常数目最高（Fig.1b, c）。

最后，对进展期头颈部鳞状细胞癌病人来源的原发肿瘤进行组织学分析，揭示了分裂后期染色体错误分离和淋巴结转移发生率存在着一种重要的联系（Fig.1d）。

Figure 1 | 人转移瘤CIN增加

a, 配对的原始肿瘤（P）和脑转移瘤（M） wGII，n=79

b, c, 983个原始肿瘤和186个转移性乳腺癌中的核型（karyotype）概率密度（b）和染色体异常情况（c）

d, 左图，头颈部鳞癌后期分裂图像。箭头所指为染色体错误分离；

右图，分别是检测无淋巴结转移和有淋巴结转移患者的肿瘤染色体错误分离

 

CIN是肿瘤转移的驱动因素

为了确定CIN与肿瘤转移之间存在因果关系，作者采用人三阴性乳腺癌（MDA-MB-231）或鼠三阴性乳腺癌（4T1）和人肺腺癌（H2030）等可移植转移瘤模型，三种模型分别有47%，55%及67%的分裂后期细胞中提示存在染色体错误分离。过表达KIF2B或MCAK移植染色体错误分离，而过表达MCAK显性负突变（dnMCAK，dominant-negative MCAK mutant，在广义上，凡一对等位基因中因其中一个突变或丢失所致的另一个正常等位基因的功能活性丧失，都称为显性负突变。换言之，显性负突变即杂合的突变产生了纯合突变的效应）则会导致MDA-MB-231细胞染色体错误分离适度增加。过表达KIF2B或MCAK不会改变细胞增殖或每个细胞所含中心体的数量（Fig.2a, b）。作者过表达KIF2A作为对照，区别是KIF2A虽也属于驱动蛋白-13蛋白家族，但缺乏着丝点和中心体定位结构域；KIF2A对分裂中期微管具有解聚活性，但对CIN却不产生影响（Fig.2b）。作者通过RhoA和Rac1的沉降试验表明小分子GTP酶的活性水平低且与驱动蛋白-13家族蛋白的过表达无关，排除了驱动蛋白-13介导的微管解聚对激活小分子GTP酶的直接作用。至此之后，称过表达MCAK或KIF2B的细胞为低CIN细胞，对照组细胞或过表达KIF2A或dnMCAK的细胞为高CIN细胞。

亲代MDA-MB-231细胞的核型表明存在广泛的异倍体（约3n）染色体，与广泛的核型异质性一致。低CIN细胞中染色体结构异常与数量性染色体异质性较少，因此提示，在单细胞来源的克隆中，抑制CIN能够减少数量性或结构性核型异质性。值得注意的是，低CIN细胞维持高水平异倍体核型，但却以稳定的形式进行细胞增殖。所以，通过染色体稳定异倍体细胞和染色体不稳定异倍体细胞进行比较，作者从实验的方式上证明了CIN对肿瘤转移的作用与细胞的异倍体状态是相互独立/无关的。

作者将MDA-MB-231细胞注入无胸腺小鼠的左心室，使肿瘤能全身性散播，并用双荧光报告基因追踪转移细胞。染色体错误分离率不同对肿瘤定植有着显著影响：注射高CIN细胞的小鼠很快死于肿瘤转移，中位生存期70天，而注射低CIN细胞的小鼠转移较少，中位生存期207天。来自低CIN细胞的转移时大时小，偶尔还会消失，而来自高CIN细胞的转移很快侵袭多数器官，进展迅速，直至死亡。注射肺腺癌H2030细胞也能观察到相似的结果（Fig.2c-e）。在表达MCAK细胞中过表达纺锤体聚集检查点蛋白 MAD2，能够部分恢复染色体错误分离，相应地减少转移（Fig.2c）。

Figure 2 | CIN是肿瘤转移的驱动因素

a，分裂后期细胞着丝粒染色（ACA）和DNA染色（DAPI）

b，表达驱动蛋白-13蛋白的MDA-MB-231细胞染色体错误分离

c，心内注射MDA-MB-231细胞7周后，动物双荧光成像（BLI）

左侧横杠代表中位数，点代表小鼠；n=12（MCAK+MAD2），20（MCAK），7（KIF2B），9（control），9（KIF2A），8（dnMCAK）；右侧示意图

d，表达dnMCAK的MDA-MB-231细胞形成转移的器官体外双荧光成像BLI

e，注射高CIN（n=33）或低CIN（n=20）MDA-MB-231细胞的小鼠疾病特异生存期

作者用MDA-MB-231或4T1细胞分别原位注射至无胸腺或免疫健全的BALB/c小鼠的脂肪垫中，然后手术切除原发肿瘤。在4T1小鼠模型中，抑制CIN对原始肿瘤的移植没有影响，甚至会加快原始肿瘤的生长。然而两个模型中，抑制CIN都能显著地减少自发性转移，延长生存期。

之后，作者评估了注射细胞和来源于原始肿瘤及转移克隆群细胞的染色体错误分离率（Fig.3a）。作者是采用MDA-MB-231细胞和两种分别来源于雌激素受体阳性(ER+)和三阴性乳腺癌（TNBC）病人的可转移移植物（PDX）模型进行分析。不论注射细胞的CIN如何，大部分转移都有较高的染色体错误分离率，而来源于大部分原始肿瘤的细胞CIN都显著较低（Fig.3b-d）。例如，当高CIN细胞（Fig.3d中dnMCAK，蓝色柱）注射入脂肪垫，原始肿瘤染色体错误分离率减小（绿色柱），而转移时在同一动物内再次自发地增加（橙色柱）。

Figure 3 | CIN在原始肿瘤和转移瘤中作用相反

a，实验方案

b-d，注射细胞内（蓝）、原始肿瘤细胞（绿）、自发转移瘤细胞（橙）或心内注射后引起的转移瘤细胞（红）中染色体错误分离率（Chromosome missegregation）

*代表染色体错误分离高于注射细胞，#代表低于注射细胞，**代表自发转移瘤细胞染色体错误分离高于相应原始肿瘤

 

CIN使细胞出现间质特点

Bulk RNA-seq证实低CIN和高CIN MDA-MB-231细胞之间1584个基因表达存在差异。主成分分析和无监督聚类精确地根据CIN的不同进行样本区分。转移相关和上皮-间质化（EMT）基因集在高CIN细胞中富集。在高CIN细胞中，前23个差异基因在先前的一个meta分析及乳腺癌患者验证组中显示能够预测无远处转移生存率（DMFS），不管肿瘤的亚型、分期或淋巴结转移。

原始肿瘤细胞或转移瘤细胞的RNA-seq显示转移瘤细胞和高CIN细胞之间存在一些相同的通路。然而，转移瘤包含大量的不同程度上调的EMT和炎症相关基因，不规律地聚集在染色体-1上，表明染色体-1特异性选择。核型分析表明注射的细胞系和大部分转移瘤存在着三拷贝的染色体-1，然而原始肿瘤只有两拷贝。所以在此模型的原始肿瘤生长过程中存在染色体-1反复缺失。

之后作者在这三个MDA-MB-231细胞系—两个低CIN（KIF2B和MCAK）及一个高CIN（dnMCAK）总共6821个细胞中进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）。用EMT基因对单细胞聚类能将大部分细胞成功地根据CIN程度区分开来，表明一部分细胞（主要是高CIN细胞）大量表达间质标志物（Fig.4a）。无监督图形聚类，基于所有表达的基因，证实存在12种表型不同细胞亚群。其中一种亚群EMT和转移相关基因表达增加（称作亚群M），同时也大量表达CIN标志基因。这个亚群由45%dnMCAK表达细胞组成，而低CIN细胞只有6%。

与scRNA-seq数据一致，离体高CIN细胞的迁移和侵袭行为增加，出现肌动蛋白细胞骨架重组、波形蛋白染色弥散、胞膜和细胞核上β-catenin增加。不出所料，过表达MAD2能够恢复MCAK过表达细胞的侵袭和迁移能力。而且，体外实验KIF2B或MCAK过表达抑制侵袭的能力依赖于细胞周期，如在瞬时转染后加入胸腺嘧啶能够阻止这一现象。

Figure 4 | CIN使细胞出现间质特点

a，热图，6821个表达MCAK，KIF2B和dnMCAK的MDA-MB-231细胞中EMT基因表达情况

b，上图为a图中所有细胞的tSNE（一种降维算法）投影

下图为基于基因集富集分析的相关通路的NES（normalized enrichment score，标准化富集评分）的热图，FDR（伪发现率）q＜0.05，图中黑色方框圈出了互相排斥的转录谱

 

CIN产生细胞质DNA

为了更好的定义CIN反应性通路，作者用scRNA-seq数据进行了基因-基因Pearson相关分析，证实存在两大基因模块：模块1特点为增殖性和代谢性通路，而模块二则是EMT和炎症基因（Fig.5a）。在scRNA-seq和bulk RNA-seq数据中，炎症相关基因、CIN标志基因、EMT基因之间存在一个强烈的正相关（Fig.4b, 5b）。

CIN会诱导炎症通路，和病毒感染相像。作者想知道是否是CIN使得基因组DNA进入到细胞质中，从而引起细胞反应引起本应用于抗病毒免疫的细胞反应。细胞核或微核被膜破裂导致基因组DNA暴露于细胞质中。作者用一种带核定位信号的GFP指示剂做活细胞成像，发现CIN与NLS-GFP溢出至细胞质无关，甚至高CIN细胞中核修复更有效。高CIN细胞的核破裂只在迁移受限的过程中出现更频繁，并且这主要有利于通过大量小的限制区（smallconstrictions）时的迁移能力增加，这与转移过程中迁移受限相似。

 然而高CIN细胞中微核多于低CIN细胞，来源于转移瘤的细胞中微核多于原发肿瘤细胞（Fig.5c-e）。为了确定是否具有破裂倾向的微核与细胞质DNA增加有关，在对细胞进行选择性细胞膜处理后，作者用两种不同的抗dsDNA抗体对细胞进行染色，发现高CIN细胞中细胞质dsDNA和单链DNA（ssDNA）增加。dsDNA信号用双链特异性核酸酶处理或DNASE2过表达后消失，证明这些抗体的特异性很强（Fig.5f）。对分离后的dsDNA水平进行定量发现低CIN细胞中的细胞质DNA比高CIN细胞减少4倍（Fig.5g）。亚细胞成分全基因组测序（30x覆盖度）证实了细胞质DNA来源于基因组。

 

 

    

Figure 5 | CIN产生细胞质DNA

a，热图，6821个细胞中基因-基因关系以及模块2中显著富集的标志基因集

b，右上，6821个表达MCAK，KIF2B和dnMCAK的MDA-MB-231细胞中关键基因标准化表达；左下，关键基因的相关性图

c，一个细胞核和一个微核的着丝粒与DNA染色

d，e，来自表达不同驱动蛋白-13蛋白细胞（d）或来自于10个原始肿瘤和28个转移瘤的细胞（e）中，微核所占百分比

f，表达MCAK和dnMCAK的MDA-MB-231细胞用DAPI和抗dsDNA抗体染色

g，高CIN细胞MDA-MB-231（n=5）和低CIN细胞H2030（n=4）中细胞质DNA/核DNA比值

h，左图，DLD-1细胞DNA染色及染色体特异性FISH探针杂交

右图，含有微核或小的细胞质DNA碎片的细胞所占比例（各条件总细胞数大于500）
i，MDA-MB-231细胞用DAPI、抗dsDNA抗体或mCherry-lamin B2（箭头所示）染色

为了确定是否是错误分离染色体为细胞质DNA提供了来源，作者采用在染色体稳定DLD-1结肠癌细胞中建立一种可诱导性Y染色体特异性错误分离系统。通过多西环素（doxycycline）和植物生长素（auxin）处理（Dox/IAA）来诱导染色体错误分离，2天后，再用靶向Y染色体或一个独立的常染色体（染色体15）的探针进行全染色体荧光原位杂交（FISH），表明Y染色体选择性地整合入微核。值得注意的是，Dox/IAA加量2-3天后，细胞质中的Y染色体特异性片段散去，而对照组常染色体依旧局限于细胞核内，表明细胞质DNA来源于高错误分离率的染色体。

通过mCherry-lamin B2过表达来抑制微核被膜破裂，能够减少细胞质dsDNA染色，而不影响染色体错误分离。相应地，mCherry-laminB2过表达也能够减少心内注射或尾静脉注射MDA-MB-231细胞产生的转移。

细胞质DNA反应引起转移

在染色体稳定细胞中，细胞质dsDNA很少，而且能被cGAS-STING通路所感受，诱导产生I型干扰素刺激基因（type I interferon stimulated genes, ISGs）。确实，Y染色体诱导错误分离会使得OAS2（ISG的一种）上调，并且DLD-1细胞中IFN-β的产生也增加。至于染色体不稳定性是如何处理持续存在的细胞质DNA还不清楚。作者发现大量cGAS定位在将近半数的微核上，和先前的一些研究观察到的一样。通过laminB2过表达来抑制微核的破裂能够显著地减少cGAS阳性微核的相对比例（Fig.6a, b）。而且高CIN细胞表现出STING水平上调且核周定位增加，与其通路的激活一致（Fig.6c）。

值得注意的是，没有证据表明高CIN细胞中下游经典的NF-κB或IFN I信号通路存在明显的激活，因为p65或IRF3磷酸化没有明显增加，未观察到p65或IRF3的核易位，检测不到IFNβ，且无法诱导ISGs。

然而，细胞质DNA能通过STING依赖性和TBK1依赖性的形式激活非经典NF-κB通路。作者发现高CIN细胞中非经典NF-κB激活激活，前提蛋白p100低水平，p52和磷酸化p100相对总p100的比值有升高趋势，非经典NF-κB通路抑制基因TRAF2水平降低。看到蛋白水平微妙的不同，作者评估了RELB核定位（RELB能与p52结合），其在高CIN细胞中的核上定位增加。常伴随细胞质染色，提示长期的通路激活。STING耗竭将减少RELB的核定位，导致EMT和炎症性通路的下调，而加入cGAMP或过表达MAD2能够增加MCAK过表达细胞中的核内RELB（Fig.6d）。

bulk RNA-seq数据证明大量的非经典NF-κB靶基因在CIN作用下发生上调（CIN-反应性NC-NF-κB基因）。scRNA-seq数据显示CIN标志基因、STING和CIN反应性NC-NF-κB基因之间存在着显著联系，相比之下，CIN和I型IFN靶基因之间的联系便很弱。相似的是，TCGA数据库中原发乳腺癌的RNA-seq数据表明，肿瘤CIN标志基因产物表达高水平，CIN反应性NC-NF-κB基因的表达也会增加，而且，非经典NF-κB通路的关键基因或其CIN反应性靶基因高表达则与乳腺癌和肺癌的预后差有关。相反的，经典NF-κB或I型IFN调节因子高表达则提示预后较好。

脑转移中，癌细胞通过肿瘤细胞非自发性机制引起cGAS激活。作者发现在高CIN细胞中去除STING、RELB或p100（由NFKB2编码），会引起高CIN细胞发生的转移减少、生存期延长、体外或体内的侵袭能力下降，说明STING和下游非经典NF-κB激活会以一种肿瘤细胞自主形式介导肿瘤转移。相反地，加入cGAMP会增加低CIN细胞的侵袭和转移（Fig.6f, g）。这些结果和先前报道提到的非经典NF-κB通路在EMT、细胞侵袭和转移中的作用不谋而合。非经典通路能够引起转移说明乳腺癌和肺癌中cGAS和STING失活突变较少。

 

Figure 6 | 细胞质DNA反应产生转移

a，MDA-MB-231细胞DNA和cGAS染色

b，存在cGAS定位（cGAS+）的微核所占比例，n=200细胞

c，细胞DNA和STING染色

d，核内含RELB的MDA-MB-231细胞所占比例，n=150细胞

e，低CIN基因表达（n=330）或高CIN基因表达（n=332）乳腺癌患者中，CIN反应性非经典NF-κB靶基因的标准化表达

f，g，心内注射分别表达对照组shRNA、STING shRNA（f）、RELBshRNA（g）或NFKB2 shRNA（g）的MDA-MB-231细胞后动物成像的光子通量（photon flux）；

对照组、STING shRNA1、STING shRNA2 组n=9，7，9（f）；

对照组、RELB shRNA1、RELB shRNA2、NFKB2 shRNA1和NFKB2 shRNA2组n=22，10，10，10和9（g）

 

讨论

文中解释了CIN、细胞质DNA感受通路的慢性激活以及转移之间存在着令人出乎意料的联系。持续染色体错误分离除了能引起肿瘤核型异质性，从而作为自然选择的一个条件；同时还能增加细胞质DNA，促进细胞转移。因此，抑制CIN能减少转移，甚至是高度异倍体细胞。STING激活的间接后果是依赖于环境的，可以引起细胞衰老乃至肿瘤形成。鉴于染色体不稳定细胞中充满了胞质DNA，作者发现这些细胞可能是通过抑制下游I型IFN信号通路而上调非经典NF-κB通路，从而将对炎症的致死上皮反应转变为了与固有免疫细胞之间的反应，产生某种形式的“免疫模拟”。恢复正常的炎症反应将提供一种靶向染色体不稳定细胞的有潜力的治疗策略。

 

CIN的出现和随后产生肿瘤耐受性是肿瘤进化中一个重要的瓶颈。作者发现CIN能够诱导基因表达从一个适宜原始肿瘤生长的增殖和高代谢状态转变为与炎症性通路上调有关联的间质化状态（Fig.4b, 5a）。先前近段时间在一个胰腺癌转移瘤基因测序中也发现这两种互相排斥的状态的存在，或许这正是原始肿瘤染色体错误分离率比转移瘤低的原因，或许也说明了为何异倍体反而不利于早期肿瘤形成。这些结果促使我们认为，CIN能驱动肿瘤向EMT和炎症方向变化，引起肿瘤转移的发生。

参考文献：doi:10.1038/nature25432