牛结核病病原实验室诊断技术的优化与进展

牛结核病（BTB）是一种由牛结核杆菌引起的慢性细菌性疾病，也可以在獾、鹿、山羊、猪、骆驼（骆驼和羊驼）、狗、猫以及人和其他哺乳动物中感染和引起结核病。这种疾病在发展中国家仍然很常见，，以及官方缺少必要的检查，就会导致官方提供的数据的不准确。

近年来，随着诊断方法的优化，实验室诊断为更有效的预防、控制和根除疾病的方案提供了很重要的参考依据。

BTB的免疫学诊断是基于在体内的迟发型超敏反应(DTH)，以结核菌素皮内试验(TST)为代表。该方法是一种间接的结核诊断方法，可以揭示出早期感染，在使用了标准的试剂和采用正确的操作程序后，可以在接触牛分枝杆菌三至八周后发现初期感染牛只。

自从1890年罗伯特·科赫（RobertKoch）推荐TST诊断方法，至今一直被世界各国广泛采用。

由科赫发现的结核菌素，经过一定的纯化改进，得到结核纯化蛋白衍生物(PPD)，广泛用于在体内BTB间接诊断。起先，进行检测的PPD是从结核分枝杆菌菌株获得，然而，到了六十年代随着技术的进步，进行测试所使用的PPD是从牛分支杆菌AN5菌株中获得。使用PPD的优点及其广泛被使用的原因是成本低，可用性高，并且长期以来缺乏用于检测BTB的替代方法。

尽管如此，该测试仍有许多已知的局限性，包括对结果的判定方面存在困难，需要进行二次操作检测，标准化程度低，测试精度不完善。Borsuk等人（2009）在来自不同国家的牛和鸟类PPD中鉴定出不同的蛋白质，具有几个不同效价效率水平，即使用于制备牛和鸟类PPD的菌株是相同的，但用于培养细菌的培养基，灭活程序和沉淀方法是不同的。另一方面，通常在不同种类的分枝杆菌中常见的PPD抗原的交叉反应，是引起敏化的最重要原因，因为它不能区分感染结核病和卡介苗，或暴露于环境的分枝杆菌。然而，该检测方法被验证是唯一有效的，并且被广泛使用了超过85年。

因此，测试的特异性不仅受到PPD的纯度，效力和剂量以及对动物反应的敏感程度严格性的影响，而且还受环境中分枝杆菌对动物致敏的影响。另外，最近有研究表明，动物的遗传背景也会对结核菌素的反应产生影响。采用TST检测方法约40-80％的受感染动物能够被检测到。显然，迫切需要对本测试方法进行重大改进优化，使其能够更准确检测，正确地执行“检测和屠宰”根除计划，减少假阳性的数量，以及假阴性结果。经过优化的检测方法肯定会提高根除控制结核病计划的有效性，并减轻养牛业的经济损失。

牛分枝杆菌感染牛的主要免疫反应受T淋巴细胞的影响。在对BTB的控制中，对细胞免疫的事前检测非常重要，因为它们能够很早就识别出分支杆菌受感染的动物。结核菌素皮内试验和干扰素-γ试验均基于结核感染中早期细胞介导的免疫应答的检测。然而，受感染个体处于晚期阶段，细胞介导的免疫反应会减弱，而不是增强体液免疫反应，因此这些测试会产生假阴性结果。这对于在没有采用或采用较差的疾病控制措施，以及晚期患病动物比例较高的情况下，对BTB的诊断是非常重要的。

因此，在发展中国家，以检测体液免疫反应为基础的血清学检测显的尤为重要。因而血清学检测正被许多国家纳入BTB的根除计划中。关于结核病诊断的血清学检测中也存在一些问题如个体间对分枝菌抗原的高度可变抗体反应和分枝杆菌菌株间的抗原变异等。

自2006年以来，干扰素-γ检测可用于验证机体响应分枝杆菌感染而产生的细胞介导的免疫应答的存在，通过此应答反应来检测分支杆菌。使用单克隆抗体干扰素-γ作用于受感染动物的T淋巴细胞而产生干扰素-γ。由于未感染牛的淋巴细胞不以特定的方式产生这种细胞因子，因此没有产生干扰素-γ的牛只个体，表明其没有被分支杆菌所感染。由于这是一种体外试验，它的优点是不干扰动物的免疫状态，并且可以在同一动物身上重复检测，但要考虑到脱敏周期。与TST检测方法相比，该检测方法可提高免疫应答的灵敏度，且反应迅速，操作步骤简洁以及可重复检测等优点。

作为结核菌素试验的辅助检测方法，干扰素-γ测定法的可以排除结核菌素试验中呈阴性的动物个体，可更早确定未被感染的个体。此检测方法可较早识别被感染动物，这可以使管理者相信，合理的决策可以建立在合理的科学原则基础上，并且可以设计出有效的方案，以便消除受感染畜群方面取得更迅速的进展。

该测定基于在用特异性抗原致敏淋巴细胞，并利用牛的PPD刺激并孵育16-24小时所产生干扰素-γ。正如前述，与结核菌素TST检测方法一样，该方法也存在一定的局限性，在采血后24小时内需要开始培养以及其检测成本比较高。ESAT6和CFP10（结核分枝杆菌复合物特异性抗原）也被用于提高干扰素-γ测定特异性，特别是在经TST检测后呈阳性群体中。这些抗原的使用还可以提供区分未接种疫苗的卡介疫苗的效价能力。

虽然血清学检测不能被认为是最优的诊断方法，但此方法被许多研究者所采纳使用。ELISA检测是用酶来标记抗原或抗体，通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法，以其简单、方便、特异性和敏感性较高而倍受欢迎。

为了诊断分枝杆菌感染的牛，通常使用的抗原是PPD和来自牛分枝杆菌的单个或相关的纯化的抗原，如Ag85的抗原，该复合物是分泌蛋白的主要成分，MPB70和它的高度同源的蛋白质MPB83。这些抗原的灵敏度和特异性大多数已经达到约90％，但它们的建立是基于反应较稳定的动物，以及在感染后期其抗体滴度的增加。

近期，一种用于检测结核多个抗原的横向流动检测方法被验证（例如在大象上使用），尽管其可能不适合于其他动物物种，例如水牛。另一个最近开发的用于动物的血清学测试是基于使用荧光偏振的抗体检测，但是此方法检测结果不稳定，在不同的环境下显示出可变的效力。

牛分枝杆菌的分离被认为是BTB诊断的“黄金标准”。然而，分离和生化鉴定所需时间较长，可能需要超过十二周的时间才能完成最终诊断，并且其灵敏度也较低。

所收集的样品需要使用氢氧化钠、硫酸、草酸或铵化合物进行净化处理，清除其他微生物，当然，这样处理样品可能影响分枝杆菌生存力，从而干扰分支杆菌培养。对个体的牛分枝杆菌进行系统化培养，主要困难在于获取样本，通常情况下在尸检和屠宰场中进行采集样品。为了克服这个限制，研究上已经提出使用鼻拭方法，作为减少样品污染的替代方法，并且此采样方法增强了结果的准确度。作为一个孤立的限制因素往往使提交的样本质量较差，因此，生产上应尽一切努力确保实验室接收质量好的样本，以便对BTB进行正确的诊断。

即使存在这些问题，但由于缩减了时间和提高了灵敏度，使用MGIT系统仍比使用固体培养基更受欢迎。尽管如此，据报道，在发现结核菌素阳性的个体中，70%的活性牛明显有结核性肺损伤;在确诊病例中，只有19%的个体从鼻腔或气管中分离出结核菌素。因此，来自细菌培养和病理数据的组合对于更准确地诊断BTB结果更加准确有效。

细菌培养表现出更高的敏感度;此外，它还提供了物种鉴定的优势。屠宰检查员的继续教育和培训同样也显得尤为重要。另外，已有报道显示液态和固体培养基的联合使用以改善细菌的敏感性。因此，改进传统的微生物快速诊断方法，在抗击人类和牛的结核病方面具有重大优势，对牛的疾病控制有深远的影响。

菌落生长和繁殖可通过其形态来初步推断牛分枝杆菌的诊断，然而，每个菌落都需要进一步的纯化分离确认。很有必要将牛分支杆菌与结核分枝杆菌复合群（Richter等，2004）的其他成员区分开来，结核分枝杆菌（人类结核病的主要原因），非洲分枝杆菌（在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌之间的中间表型位置），微小杆菌（一种很少遇到的“田鼠杆菌”），海豹分支杆菌和Caprae分支杆菌等。这突出表明需要更灵敏，准确和快速的方法来协助控制这种人畜共患病，例如分子检查方法。

进行判定引起人和牛结核病的生物之间的区别并不是一个简单的过程。其中将分枝杆菌与物种区分开就是一个主要的问题，以及缩短在判定鉴别过程中所需要的时间，因此分子诊断这种多样性的检测技术是很有必要的。传统上采用基于生长，形态和生化特性的一系列经典测试来分离结核分枝杆菌复合群。然而，这些传统的检测方法存在一定的弊端，检测过程复杂，耗时长，准确性较差，重复性效果不佳，且不宜在实验室内操作。

因此，聚合酶链式反应（PCR）已经成功地用于检测结核分枝杆菌复合物的成员，并且特别适用于在牛组织样品中直接检测牛分枝杆菌。

此外，PCR检测技术可以检测到浸泡过福尔马林的样品中牛分支杆菌DNA。然而，目前采用PCR检测结核分枝杆菌比细菌培养技术更不敏感。因此，进一步提高PCR灵敏度和标准化操作方法显得尤为重要。

已有报道提出了不同的PCR方法用于快速检测少量的牛分枝杆菌DNA。这些方法主要用于验证在屠宰检查中肉眼可观察到疑似牛分支杆菌引起的病变，以及检测在牛奶样品中发现牛分支杆菌。关于使用PCR诊断BTB，这种方法已被广泛用于检测牛奶中的分枝杆菌，新鲜组织以及被浸泡在福尔马林中或被石蜡包被的组织。一些引物已被用于扩增16S-23SrRNA序列，插入序列为IS6110和IS108，以及编码蛋白的基因，如24kda的MPB70,38 kDa抗原B和HSP的65kDa。

一种被使用的方法是基于RD7的DNA序列的扩增，该序列存在于结核分枝杆菌中，并没有出现在牛分支杆菌中。然而，这种缺失也存在于田鼠分支杆菌、一些非洲分枝杆菌以及海豹分支杆菌中，这使得检测结果存在不确定性。在使用该技术的过程中，对不同物种的高特异性寡核苷酸的扩增和可获得性的基因组DNA的提取，以及交叉污染，这些步骤有待优化，这些也是长期限制分子方法标准化所存在的问题。这些检测结果的特异性和灵敏度，受很多因素的影响，例如使用样品的类型，采用不同的方法制备的样品以及扩增系统等，这些只能通过实验室可靠的科学实验来制定标准化的方法。

虽然采用直接PCR可以产生快速的检测结果，但是建议使用平行样，用细菌培养物加以确定牛分枝杆菌。然而，PCR已经观察到在牛奶中的牛分枝杆菌比细菌培养检测结果更敏感，这一事实可能归因于培养前的去污过程中杀死了大量的细菌所导致。

目前，只有一种商业上可用于鉴别结核的诊断试剂盒，该试剂盒测定使用gyrB基因中高度稳定的单核苷酸多态性（SNP）来区分结核的不同成员。然而，这种诊断试剂盒存在一定的局限性，因为它不区分田鼠分支杆菌和海豹分支杆菌。