α7烟碱型胆碱能受体激动剂对体外循环致大鼠脑损伤及核转录因子-κB-p65蛋白表达的影响

计流　孙莹杰　张铁铮

110016，沈阳军区总医院麻醉科（计流、孙莹杰、张铁铮）；442008，十堰市太和医院麻醉科（计流）

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【论著】

研究发现α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）激动剂可通过胆碱能抗炎通路（CAP）来抑制炎症，从而对脑组织的伤害起到保护作用。本研究通过观察大鼠脑损伤标记物S100β、炎症因子和NF-κB表达的变化，初步探讨α7nAChR激动剂对CPB致脑损伤保护作用及可能机制。

1.1　动物选择与分组

健康成年清洁级雄性SD大鼠24只，体重350~400 g，按完全随机数字表法分为4组（每组6只）：假手术组（S组）、CPB组（C组）、α7nAChR激动剂组（P组）、α7nAChR拮抗剂组（M组）。具体处理如下：S组仅在各部位插管不转流+机械通气60 min；C组于CPB前30 min腹腔注射等量生理盐水+CPB 60 min；P组于CPB前30 min腹腔注射PHA568487（0.8 mg/kg）+CPB 60 min；M组于CPB前30 min依次腹腔注射PHA568487（0.8 mg/kg）和甲基牛扁碱（6 mg/kg）+CPB 60 min。

1.2　CPB模型制备

大鼠术前禁食6 h，不禁饮。腹腔注射10%水合氯醛（每100 g体重给予0.3 ml）麻醉后，用16 G 套管针透光法进行气管插管，连接小动物呼吸机行机械通气。右股静脉置24 G 套管针，输注6%；左股动脉置22 G 套管针用于监测实时动脉压和动脉血气分析，置管后立即给予250 U/kg肝素；尾动脉穿刺置22 G套管针及右颈静脉置管18 G套管针（头端侧面开孔）用于建立CPB，采用无血预充和α稳态血气管理。维持转流过程平稳。转流后2 h动物仍存活则视为模型成功，本组实验模型成功率为92%。

1.3　标本采集及测定

于CPB术后2 h、脊椎脱臼法处死实验动物，经颈内静脉采血3 ml，即刻4 ℃、3 000 g、10 min离心出血清，再倒入1.5 ml离心管中，保存于-80 ℃深低温冰箱中待测。ELISA法检测血清S100β、IL-6和TNF-α的浓度。取左侧海马组织，采用Western blot法检测NF-κB-p65蛋白的表达。另取右侧海马组织，10%中性甲醛固定、过夜，脱水，石蜡包埋，连续切片（切片厚度4~6 μm），H-E染色，光镜下观察海马组织病理学结果。

2.1　各组大鼠海马组织形态学改变

H-E染色结果如图1所示，S组海马锥体细胞形态正常，排列整齐、胞质染色均匀，核仁清晰，细胞结构未见明显异常，仅见少量炎细胞浸润；C组锥体细胞排列疏松，基线消失，核固缩，大量锥体细胞死亡；P组受损情况较C组轻，细胞和基线紊乱程度减轻，仅见少量锥体细胞死亡；M组受损情况较C组更加严重，锥体细胞大量死亡，几乎见不到正常细胞结构。

2.2　各组大鼠血清S100β、TNF-α和IL-6水平

与S组比较，C组、P组和M组S100β、TNF-α和IL-6水平均显著升高（P<0.05）。与C组比较，P组S100β、TNF-α和IL-6水平明显降低（P<0.05），M组与C组各指标差异无统计学意义（P>0.05，表1）。

2.3　各组大鼠海马组织NF-κB-p65蛋白含量

与S组比较，C组、P组和M组NF-κB-p65的表达显著升高（P<0.05）。与C组比较，P组NF-κB-p65表达明显降低（P<0.05）；M组NF-κB-p65表达明显高于C组、P组（P<0.05，表2、图2）。

Duris等通过局灶性脑缺血大鼠对PHA568487和甲基牛扁碱剂量反应研究发现腹腔注射PHA568487（0.8 mg/kg）、甲基牛扁碱（6 mg/kg）更有利于实验结果观察、行为学评估和脑保护作用实验研究。因此，本实验采用此种剂量腹腔注射进行观察研究。

CPB期间低血压、搬动心脏影响心排血量等因素均可导致脑灌注不足及脑组织氧供下降，其最直接的后果是脑氧供需平衡障碍及氧债的发生。手术创伤可引起损伤相关模式因子介质释放，损伤相关模式因子作用于外周巨噬细胞激活NF-κB，激活的NF-κB增强促炎症因子TNF-α、高迁移率族蛋白B1、IL-1等的转录合成与释放，反过来，这些促炎症因子又可以激活各自相应受体增强NF-κB的转录。通过这种级联放大作用，局部炎症反应亦可导致全身炎症反应综合征。系统性的细胞因子，尤其是TNF-α，可以破坏血脑屏障，使得外周活化的免疫细胞和炎症因子更加容易进入中枢神经系统。这些免疫细胞和炎症因子一旦进入中枢系统就会触发神经炎症，引发脑损伤。

研究发现，血清S100β与CPB时间具有相关性，且血清S100β浓度在CPB期间降低，CPB停转流后达到高峰，之后呈下降趋势。脑脊液S100β比血清S100β能更好地评估CPB术后脑损伤，但大鼠脑脊液非常有限，且血清中S100β较其他指标而言更有效。本研究结果显示，与S组比较，C组血清S100β浓度显著升高，海马区损伤更为严重，提示CPB能促发脑损伤；C组血清IL-6、TNF-α水平明显升高，提示CPB促发脑损伤与炎症反应有关。

免疫细胞，尤其是巨噬细胞表面的α7nAChR在CAP中发挥着核心作用。CAP通过网状内皮系统支配的器官分泌乙酰胆碱来抑制炎症，这些器官包括肺、脾、肝、肾以及胃肠道。乙酰胆碱与巨噬细胞和其他免疫细胞表面α7nAChR相互作用，可通过抑制NF-κB 信号通路减少促炎细胞因子的释放减轻组织损害。α7nAChR激活后通过调节单核细胞和巨噬细胞内级联信号转导链来抑制NF-κB转录和Toll样受体4表达，最终抑制促炎细胞因子转录。

本研究结果显示，与C组比较，P组脑组织NF-κB-p65蛋白表达下降，血清IL-6、TNF-α、S100β水平明显降低，光镜下海马区脑组织损伤程度明显减轻。加入抑制剂甲基牛扁碱后，大鼠海马病理损伤比C组严重，NF-κB-p65表达升高亦比C组高，提示甲基牛扁碱除了使PHA的作用消失外，可能还会加重损伤，其机制尚未明了。