厌氧氨氧化（Anammox）作为一种高效节能的脱氮水处理工艺，已经在多个国家启动运行。其主要特征是直接将亚硝酸氮和氨氮在厌氧条件下转化为氮气（图1）。相较于传统脱氮工艺，该工艺具有缩短硝化进程、降低需氧量、减少剩余污泥产生量和温室气体排放量等优点。但是厌氧氨氧化菌群对外界条件波动非常敏感，如溶解氧、有机质含量、温度、pH以及基质的改变均会造成厌氧氨氧化工艺的不稳定性，仍然是需要突破的瓶颈。一些研究团队针对该问题提供了一些解决方案。比如添加微生物载体为细菌提供更合适的附着位点，使之形成稳定菌群或者能够抵抗外界冲击的生物膜，推广厌氧氨氧化的应用。同时，也有一些团队从运行策略上进行调控来减少环境波动对厌氧氨氧化菌的影响，比如用连续流代替序批式反应器，可操作性高。然而，在如何调控厌氧氨氧化菌代谢、提高其竞争力和生存能力等方面，还尚待深入研究。
▲ 图1 氮循环中的厌氧氨氧化（anammox）
如同人类一样，细菌不是一直以单个个体独立生长和行动，它们之间也会通过特殊的“语言”进行交流从而表达一些在群体规模才会发生的生物特征。这一现象被称为细菌的通讯，而通讯必需的“语言”则为信号分子。通常意义上，信号分子可以分为第一和第二信号分子，其中第一信号分子负责胞外信号输入，而第二信号分子指的是受到第一信号分子刺激之后所发生的胞内信息传递。环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌内广泛存在的第二信号分子，调控着广泛的生理活动，包括细胞生长转化、团聚活动、粘附性、生物膜的形成以及动植物病原菌的毒性。因此，c-di-GMP通讯信号是近年来的一个研究热点，特别是针对其在环境领域中的应用，需要系统的探索和认知。
在此前提下，来自北京大学刘思彤研究员的研究团队受启发于细菌通讯对细菌生命活动的影响和调节，致力于研究水处理领域厌氧氨氧化菌群中的细菌通讯及其调控机制，为解决厌氧氨氧化工艺的瓶颈问题提供研究思路。
厌氧氨氧化菌J.caeni中c-di-GMP转化蛋白的鉴定及其功能分析
第二信号分子c-di-GMP是细菌生命活动重要的调控因子，可参与调控细菌多种代谢活动。基于此，厌氧氨氧化菌是否具有合成并转化c-di-GMP的能力，是研究c-di-GMP调控厌氧氨氧化菌作用机制的基础性问题。
▲ 图2 c-di-GMP合成和降解示意图
由图2所示，c-di-GMP由鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase, DGC）以两分子的GTP（guanosine 5’-triphosphate）为底物合成。也可以被具磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）降解为pGpG（linear 5’-phosphoguanylyl-(3’,5’)-guanosine），或被另一种磷酸二酯酶降解为两分子的GMP（guanosine 5’-monophosphate）。而需要说明的是，有的蛋白同时具备合成和降解c-di_GMP的功能，称之为双功能酶（dual-function）。
研究团队在厌氧氨氧化菌Candidatus Jettenia caeni中鉴定出13个具有潜在合成和降解c-di-GMP功能的蛋白序列。依据相应蛋白核心功能的保守位点，进一步筛选出一个高保守性的双功能c-di-GMP转化酶（KSU1_C0413，命名为JcaA），并对JcaA进行功能鉴定。
为确认JcaA蛋白酶是否具有合成和降解c-di-GMP的功能，研究团队将JcaA基因导入大肠杆菌E. coli中后大量表达，分离纯化得到JcaA蛋白，其分子量约为76.4kDa。通过JcaA蛋白酶与相应的底物反应，检测出JcaA蛋白酶可以将GTP合成c-di-GMP，同时也可以将c-di-GMP降解为pGpG，表明该蛋白酶具备同时合成与降解c-di-GMP的功能。为确认JcaA基因是否在J. caeni菌中正常表达，研究团队对JcaA的信使RNA（信使RNA能翻译生成JcaA蛋白酶）进行检测。这种检测方法是在混合菌群（如活性污泥）中分析基因表达的有效而灵敏的方法。在J. caeni菌的稳定培养期，进行信使RNA的检测，发现JcaA基因确实发生了转录，说明该基因在厌氧氨氧化菌J. caeni的生命过程中起着作用。
长期变换负荷下c-di-GMP调控厌氧氨氧化菌群团聚
最近研究结果显示c-di-GMP是绝大部分细菌控制生物膜形成和团聚的关键调控因子。高浓度的胞内c-di-GMP可以降低运动性并增加胞外聚合物（EPS）的合成，最终影响生物膜形成。相反，当胞内c-di-GMP浓度降低，细菌会增强运动性并从生物膜上脱落。而生物膜的形成有助于提升活性污泥对不利环境的抵抗能力，这对于研究厌氧氨氧化污泥对不利环境敏感的瓶颈问题有着重要意义。基质浓度的波动变换无论是在工业生活污水中还是在自然环境中均广泛存在。因此，很有必要进一步考察厌氧氨氧化菌群在营养物质变换条件下的生理行为和代谢的响应。
两个序批式反应器（R1和R2）分别在两种不同的负荷供给策略下稳定运行135天，R1作为对照组执行常规的逐步提高进水负荷的策略，R2作为实验组执行变换负荷的运行策略。具体来说，R1反应器的氮负荷率（NLR）采用逐步提高进水负荷的方式运行，即每当出水中NO2--N和NH4+-N的浓度均低于20 mg N/L时，便提高进水氮素浓度。R2反应器在运行过程中，采用每周高于或低于R1反应器0.13 kg-N/(m3d)的NLR的运行策略。研究团队发现，变换负荷下厌氧氨氧化污泥的团聚过程明显更快，并且能在之后的运行过程中，保持更稳定的状态。对反应器长期运行条件下的粒径、c-di-GMP浓度及胞外聚合物（PN、PS、PN/PS）分别进行了统计分析，发现在污泥快速团聚的过程中，粒径与c-di-GMP和EPS含量分别有着显著的正相关关系，同时c-di-GMP浓度也与EPS含量之间有着显著的正相关关系。
为进一步探索上述过程的调控机理，研究团队采用16SrRNA转录本测序和代谢组学联用的手段，检测厌氧氨氧化菌群中的代谢活跃菌群和相应的代谢差异。研究发现，在短期冲击负荷下厌氧氨氧化菌群中的变形门有着显著的上调。变形门菌有着完整的c-di-GMP代谢通路，推测其上调很可能是导致菌群中c-di-GMP水平的提高的主要原因。代谢组学的结果表明，冲击负荷下更多的疏水性氨基酸用于胞外蛋白的合成，使得胞外蛋白含量增加。靶向代谢组结果显示c-di-GMP浓度的提高，可促进多糖合成前体物质alginate和PNAG含量的升高，从而表明c-di-GMP可调控EPS的分泌，进而促进团聚的形成。这说明厌氧氨氧化菌群c-di-GMP调控EPS生成是提高其对不利环境耐受性的重要机制。这些结果突出了c-di-GMP在厌氧氨氧化菌群中的重要作用——抵抗环境压力。
▲ 图3. 信号分子c-di-GMP调控团聚图示
总结与展望
研究团队主要集中在细菌通讯对厌氧氨氧化菌群的影响，为解决其瓶颈问题——对环境敏感进行了针对性的分析。在细菌代谢和基因层面解析信号分子对菌群的调控机理，基于其调控机制试图进行下一步技术层面的可行性分析。
从已有的研究成果来看，厌氧氨氧化菌群中的信号分子种类不仅限于c-di-GMP。而菌群的通讯与交互作用的复杂程度值得更深入的挖掘和探讨。研究团队会更全面的进行多种信号分子的检测与调控验证，主要侧重多种信号分子之间的互相影响，从细菌通讯的角度理解菌群的交互作用与调控机理。在技术层面，通过以上的研究基础，进行精准的信号分子的调控，如构建信号分子发生菌、形成耦合菌群、确定生物强化反应器模式和运行形式等等。
参考文献
Yongzhao Guo, Sitong Liu, Xi Tang, Chao Wang,Zhao Niu, Ying Feng. Insight into c-di-GMP regulation in anammox aggregation inresponse to alternating feed loadings. Environmental Science & Technology. 2017, 51(16): 9155–9164. DOI: 10.1021/acs.est.6b06396
Yongzhao Guo, Sitong Liu, Xi Tang, FenglinYang. Role of c-di-GMP in anammox aggregation and systematic analysis of itsturnover protein in Candidatus Jetteniacaeni. Water Research. 2017, 113: 181-190. DOI:10.1016/j.watres.2017.02.018
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