WB蛋白样品制备的细节,你知道几个?

2023-05-10 14:56:27


聚研小编

聚研是CST、Merck-Millipore的授权代理,品质保证!以下WB蛋白样品制备技能来自CST《WB成功指南》和Merck《WB宝典》。



01

使用新鲜样本


新鲜裂解产物由于降解水平较低,因此能产生更强的特异性信号和更低的背景。CST科学家比较了新旧处理的小鼠大脑裂解物Trk条带信号:1年前的大鼠脑裂解样品Trk条带弱、特异性差且背景高,而3个月的大鼠脑裂解样品Trk条带粗、特异性好且没有背景(图1)

图1:WB分析小鼠大脑提取物,使用前三个月制备(新)或使用前一年制备(旧),采用Trk(pan)(C17F1)Rabbiot mAb #4609



02

超声充分裂解样品


相较于单独使用裂解缓冲液RIPA,超声处理破碎细胞膜和核染色质的程度更大。而且超声对于研究细胞核和核染色质相关蛋白至关重要,如Histone H3。CST的科学家比较了未经超声处理的样本和经超声处理的样本中Histone H3条带信号,并在经超声处理的样本中观察到了显著增强的Histone H3条带信号, 而未经超声处理的样本中无Histone H3条带。

图2:WB分析CKR/PAEC细胞提取物,使用或未用超声裂解处理,使用P-Histone H3(Ser 10) Antibody #9701



03

抑制蛋白降解


组织或细胞内通常中含有大量的蛋白酶/磷酸酶,在提取过程中这些蛋白酶/磷酸酶被释放出来,降解蛋白。尤其对于低表达的蛋白或磷酸化蛋白样品制备,更要加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂(如图3),来抑制其蛋白降解。

图3-1:各种蛋白酶/磷酸酶抑制剂


注意: 实验室常用的PMSF(#8553)便宜,但是只能抑制一种蛋白酶即丝氨酸蛋白酶,而且在水溶液中稳定性差,30min就降解掉一半。而使用蛋白酶/磷酸酶抑制剂cocktail——1瓶含多种蛋白酶抑制剂能更有效抑制剂多种蛋白酶/磷酸酶。


图3-2:蛋白酶抑制剂cocktail:1瓶富含6种蛋白酶抑制剂混合物,抑制4种以上蛋白


图3-3:Merck磷酸酶抑制剂Cocktail#524625-1SET:1瓶富含5种磷酸酶抑制剂,搞定3类磷酸酶


图3-4:CST磷酸酶抑制剂Cocktail#5870S:1瓶富含4种磷酸酶抑制剂,搞定3类磷酸酶


备注:还有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合液#5872s(包含5871+5870)



04

特殊蛋白的分离提取


实验室常用的RIPA裂解液,一般用来提取总蛋白。但RIPA无法做到特异蛋白的分离提取,如分离核蛋白和胞浆蛋白。因此需要用蛋白抽提试剂盒, 针对目的蛋白的不同来源和不同组织定位进行裂解和提取。


(1) 提取更多可溶性蛋白:与RIPA(#20-188)相比,CytoBuster可溶性蛋白抽提试剂(#71009)能抽提更多的可溶性蛋白,增加低丰度蛋白的检测效率。

图4-1:提取MCF-7细胞蛋白中乳腺癌生物标志物蛋白,CytoBuster得率显高于RIPA。


(2) 核蛋白和胞浆蛋白分离提取:核蛋白和胞浆蛋白分离抽提试剂盒(#71183)能有效分离提取核蛋白和胞浆蛋白,高文献引用率,操作方便(全部操作在一个小离心管中),仅需30分钟完成。


(3) 膜蛋白提取:细胞表面受体(主要是各种膜蛋白)一般难溶解于常规抽提试剂,种类复杂而又多为低丰度蛋白,因此提取研究膜性蛋白及其复合物是非常困难的。ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒(#71772-3)能温和、高效地从哺乳动物细胞和组织中抽提跨膜蛋白(跨膜次数多达7-12次),特别适合GPCRs等信号通路受体蛋白及其复合物。


图4-2:膜蛋白及膜相关蛋白的标志性蛋白的免疫印迹——使用ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒。第3,6道为膜蛋白,第1,2,4,5为总蛋白或非膜蛋白。


(4) 细胞骨架蛋白提取:细胞骨架蛋白(包括肌动蛋白和大量相关蛋白)的变化涉及细胞内物质转运、细胞运动、增殖等重要功能,也是细胞周期调控和癌转移研究中的热点。ProteoExtract细胞骨架富集及分离试剂盒(#17-10195)特异性、温和高效抽提活性细胞骨架蛋白,有效消除其它成分干扰


(5) 线粒体蛋白提取:ProteoExtract胞质/线粒体分离试剂盒(#QIA88)利用独特的抽提试剂从哺乳动物细胞中抽提得到两种不同的蛋白质组分:线粒体组分及胞质组分。操作简单易行,不需要超速离心的步骤。得到的蛋白组分可直接用于1D及2D凝胶电泳、免疫印迹、凋亡及信号转导相关的靶蛋白细胞内移位研究。



05

保持低温


提取蛋白时,所有的步骤都要在冰上进行、所有的试剂都需预冷,以降低蛋白酶活性,防止蛋白降解。尤其是磷酸化蛋白,因为磷酸化蛋白在室温条件下很容易被磷酸酶降解,即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持!低温!环境!



06

去掉核酸干扰


Benzonase核酸酶(#70664-3)可以降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线形和环状),迅速降低样品粘度, 增加蛋白产量。


图6:经Benzonase核酸酶处理蛋白样品粘度显著降低



07

去掉高丰度蛋白


ProteoExtract高丰度蛋白去除试剂盒(#122643-1KIT)可以从体液(如血浆/血清/脑脊液等)中高效、特异性地除去白蛋白和IgG,从而显著降低样品的复杂性,增加低丰度蛋白的检测。



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