甲基化入门知识手册

【本期目录】

一、甲基化的类别

1.DNA甲基化

2. 蛋白质甲基化

二、甲基化的鉴定方法

1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）

2、亚硫酸氢盐测序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）

3、高分辨率熔解曲线法（HighResolutionMelting，HRM） 

三、甲基化在胚胎发育过程的变化

四、甲基化在衰老过程的变化

五、甲基化与X染色体失活

六、甲基化的功能

七、甲基化与疾病

九、甲基化抑制基因转录的机制

①直接抑制

②间接机制

③影响染色体结构 

十、人类基因组DNA甲基化的基本特征

①时空特异性

②亲缘特异性

③病理特异性

十一、DNA甲基化测序方法

(1)重亚硫酸盐测序

(2)重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)

(3)限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)

(4)氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)

(5)TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)

(6)甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq)

(7)HELP-Seq

(8)甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP)

(9)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP)

(10)基于探针的靶向富集技术

十二、三代测序技术检测甲基化的原理

(1)PacBio

(2)nanopore

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一、甲基化的类别

1.DNA甲基化

DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。

2. 蛋白质甲基化

蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs）将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸，或者在每个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸）赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。在组蛋白中，蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达，从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。

 

二、甲基化的鉴定方法

1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2、亚硫酸氢盐测序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

3、高分辨率熔解曲线法（HighResolutionMelting，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

 

三、甲基化在胚胎发育过程的变化

（1）在受精之前，精子和卵细胞中的DNA甲基化程度都很高；而在受精之后，父母的表观遗传记忆都被大规模擦除，到植入前的囊胚阶段，胚胎的DNA甲基化水平降到最低点。但是在这一全基因组范围的DNA去甲基化过程中，标记着印记基因的DNA甲基化得以精确维持和保留。

（2）在受精之前，精子基因组DNA甲基化程度显著高于卵细胞，而在受精之后来自精子的父源DNA去甲基化的速度快于来自卵细胞的母源DNA。到受精卵晚期，父源DNA甲基化程度已经低于母源DNA的甲基化程度。

（3）受精卵基因组DNA去甲基化过程呈现强烈的异质性，在相同发育阶段的不同受精卵中，基因组DNA的甲基化程度有显著差异。

（4）在人类早期胚胎DNA甲基化组的大规模去甲基化过程中，相比于进化上更年轻、更活跃的转座子，进化上更古老的转座子重复序列上的DNA去甲基化程度更彻底，说明人类早期胚胎在植入前的发育过程中巧妙地在擦去表观遗传记忆和抑制转座子重复序列的转座活性之间取得了平衡。

（5）在人类卵母细胞中的非CpG位点上存在相对较高的DNA甲基化修饰，基因区的非CpG位点的甲基化程度跟相应基因的表达成正相关关系，说明非CpG位点的甲基化可能参与调控基因转录。

 

四、甲基化在衰老过程的变化

对于多数脊椎动物的组织，其基因组中总甲基胞嘧啶的含量随衰老而倾向于减少，从而引起基因组中低甲基化。主要由于：

1.DNA甲基化外源性调节与衰老

外源性因素，如与衰老相关的营养因素参与了DNA 低甲基化。食物甲基化供体摄入的不足有可能导致某些基因启动子发生去甲基化，而这些标记的改变可能会导致病理情况的发生和发展，如肥胖、2 型糖尿病、癌症、心血管系统疾病、神经退行性疾病和免疫性疾病等一系列老年性疾病。此外，食物中微量元素的不足也会影响DNA 的甲基

化。在老年人中，微量元素锌、硒等的缺乏会导致一碳代谢的改变，从而也会引起基因组DNA 的低甲基化。

2.DNA甲基化内源性调节与衰老

DNA 甲基化的内源性调节因素主要指机体内DNA 甲基转移酶和去甲基化酶的活性水平和体内其他因素对DNA 甲基化水平的调节。

(1)DNA甲基化酶活性改变

随着年龄的增加，对于保持异染色质DNA 超甲基化状态起重要作用的Dnmt1 活性逐渐降低，引起被动去甲基化，进而引起在衰老过程中，基因组的DNA 甲基化被逐渐消耗。从出生到衰老的过程中，Dnmt1 的表达量显著减少，并且Dnmt1 的活性降低可能导致在有丝分裂过程中甲基化模式复制减少。

(2)叶酸代谢的障碍

随着年龄的增加，作为甲基供体之一的叶酸的摄入及其可利用率降低，叶酸也逐渐减少。衰老时由叶酸调节一碳代谢通路中的高半胱氨酸含量增加。而一碳代谢中甲基转移的紊乱是引起血液中高同型半胱氨酸增加的一个主要原因，这也同时增加细胞的S- 腺苷高半胱氨酸，进而抑制DNA 甲基转移酶活性，导致基因组低DNA 甲基化状态。

(3)激素水平的改变

随着年龄的增大，动物机体内的激素水平也相应地发生一系列的变化。这些激素对于基因组的DNA 甲基化状态也产生了一定的影响。随着年龄的增加，性激素的减少可能会引起低DNA 甲基化。

 

五、甲基化与X染色体失活

哺乳动物中, 雌性体细胞内存在两条X染色体, 而在雄性体细胞内只存在一条X染色体, 这就要求必须对不同数量的X染色体进行剂量补偿,使雌性个体中的一条X染色体失活。失活的X染色体保持低转录水平与滞后复制,其与结构性的异染色质相似,但在看家基因启动子的GpC岛处发生了甲基化。X染色体失活可以防止雌性个体体内双倍X基因发挥功能,从而维持雌性体细胞正常的生长发育。

哺乳动物中GpC岛胞嘧啶的甲基化与X染色体失活密切相关,若GpC岛甲基化缺失,X染色体失活状态将不稳定。研究表明,X染色体失活是由X失活中心(Xinactivationcenter,XIC)顺式控制的,包括启动、计数、选择、建立与维持等复杂的过程。X染色体失活一旦建立则保持稳定,其所有的子细胞均失活同一条X染色体。当一个卵子与精子形成一个雌性胚胎时,X特异性失活转录本(Xinactive-specifictranscript,xist)可以通过甲基化使来自于父方的那条染色体失活。xist基因5′端在活性的X染色体中是完全甲基化的, 而在失活的X染色体上则是非甲基化的, 也就是说xist基因是在失活X染色体上转录而在活性X染色体上不转录的唯一基因, 即xist基因的甲基化是相应染色体保持活性的保证。

 

六、甲基化的功能

DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

 

七、甲基化与疾病

甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记丢失导致多种肿瘤。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。

 

八、甲基化的发生机制

DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶家族来催化完成的。研究人员在真核生物中发现了3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1一种是维持性甲基化酶;Dnmt2可与DNA上特异位点结合，但具体作用尚不清楚;Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化。在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期，其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞；在细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。

 

九、甲基化抑制基因转录的机制

①直接抑制

CPG岛甲基化直接干扰tf与调控区DNA的结合。例如camp反应元件结合蛋白(creb)，ap-2，e2f，nfkb等tf不能与相应的DNA位点相结合。但有些tf如sp1，ctf与甲基化和非甲基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体内tf与DNA相结合。

②间接机制

近年来发现一些甲基化DNA结合蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化CPG结合蛋白如mecp1，mecp2与甲基化DNA特异结合，抑制基因转录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动子，但对强的启动子则收效甚微。

③影响染色体结构

DNA甲基化还可通过影响染色体结构来抑制转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起始转录，而且mecp1与甲基化启动子CPG位点结合后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转录因子不能与其相结合，从而抑制转录。DNA甲基化状态并非固定不变。在许多哺乳动物组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、心脏和脾脏内发现DNA脱甲基化作用。相反，大鼠肺则不发生脱甲基化，大鼠肾内甲基脱氧胞苷总含量增加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化和脱甲基化，但总的说来，最常见的变化似乎是进行性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基因表达变化。

 

十、人类基因组DNA甲基化的基本特征

①时空特异性

DNA甲基化是记录细胞分化历史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学者认为，DNA甲基化可能使分化细胞基因组重新编程，通过DNA甲基化来控制基因的时空表达，调节发育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段，基因组DNA上各CPG位点甲基化状态的差异构成基因组DNA甲基化谱,组织特异的DNA甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。细胞之间甲基DNA化模式的差异是在个体发育的过程中逐步形成的，并在以后的有丝分裂中保持不变。在胚胎发育过程中，细胞的甲基化模式按一定方向发生有规律地变化。成年个体，组织特异性基因形成组织特异性的甲基化模式。随着年龄增长，基因组DNA甲基化总体水平不断下降。特定片断DNA的甲基化程度可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。

②亲缘特异性

在某些基因座，所有组织体细胞都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化．呈现亲缘依赖的等位基因甲基化模式。

③病理特异性

在病理状态下，组织细胞的DNA甲基化谱发生特异性的改变。DNA甲基化改变在许多肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实，启动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。

 

十一、DNA甲基化测序方法

(1)重亚硫酸盐测序

该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重烟硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而，可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。

(2)重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)

为了避免重亚硫酸盐处理时模板的丢失，通常会在重亚硫酸盐处理后进行接头连接和随机引物的扩增。

(3)限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)

该技术是指对基因组上CpG岛或CpG甲基化较密集的区域进行靶向测序。样本首先经几种限制酶进行消化处理，然后经重亚硫酸盐处理，最后再测序。这种方法可以发现单个核苷酸水平的甲基化。

(4)氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)

5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)是5’甲基胞嘧啶脱甲基成胞嘧啶过程的中间产物，重亚硫酸盐测序无法对二者进行区分。通过氧化-重亚硫酸盐测序，5’甲基胞嘧啶保留，而5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，进而脱氨基成尿嘧啶。通过将经过氧化处理和未处理的样本进行测序比较，即可从单个碱基水平分辨5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)和5’甲基胞嘧啶。

(5)TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)

TAB-seq采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用来保护免受TET蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，进而可以从单个碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。

(6)甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq)

MRE-Seq将甲基化作用的敏感性和限制酶的特异性结合起来进而鉴定CpG岛的甲基化状态。

(7)HELP-Seq

HELP-Seq采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性内切酶MSPI处理，来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较，进而实现甲基化测序。

(8)甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP)

MeDIP是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。

(9)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP)

MBD-CAP技术利用甲基化DNA能够结合蛋白MeCP2,MBD1-2和 MBD3LI来对甲基化的DNA进行免疫沉淀。与MeDIP技术相似，该技术也是可以发现基因组中高度甲基化的区域，不能从单个碱基水平分析甲基化。

(10)基于探针的靶向富集技术

甲基化测序靶向富集技术采用合成寡核苷酸探针来捕获CpG岛、基因启动子区域以及其他一些显著性甲基化的区域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有这种商品化的试剂盒。

 

十二、三代测序技术检测甲基化的原理

(1)PacBio

PacBio RS II利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。当碱基有额外修饰时，DNA聚合酶的合成速度会减慢，对应的信号会被检测出来。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”PacBio RS II产生微小差异，最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。除了甲基化修饰，还可以检测5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰，甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。PacBio平台可以在测序的同时即可检测表观遗传学修饰信息，只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息。

(2)nanopore

nanopore平台也能够监测修饰的碱基，因为甲基化同样会影响鉴定到的电压的变化。这使得甲基化的测序可以在不需要化学操作的条件下进行。