森辉微课堂|怎样做好离子交换层析?

因为缓冲液、样品或洗脱液都是流动相,可在流经柱时进行分离。在分离过程中未被吸附的物质不断流出反应体系,使平衡不断右移,是一种动态平衡,所以又称为动态操作。这种操作方式分离效果好,适用于各类样品,操作方式为连续操作。在层析操作中,柱的填装情况对分离有一定的影响,介质在柱中要分布均匀,尤其不允许气泡存在,也应防止产生分层现象。

对于一些黏度较大的样品,进行初步提取分离时,也可采用“静态”处理方法。将离子交换剂与需处理的工作液在反应容器中进行搅拌,当达到平衡后,将残液与介质分离,再将离子交换剂装入柱中进行洗脱。这种方式又称分批操作。该法工艺设备简单,易于操作。如肝素钠等一些天然产物的初步分离,往往采用这种静态方式。若以静态方法操作,应适当控制离子交换剂在工作液中的搅拌速度。若搅拌速度过快,剪切力过大,可致使离子交换颗粒粉碎,难以进行过滤分离。如果搅拌速度过慢,影响介质与工作液之间的接触,也影响交换速率。

固定床分离:在柱式操作中,料液为流动相,自上而下的流动,在流动过程中进行吸附，为得到较好的分离效果,要求分离柱底部有孔度分布均匀的筛板,以防止流动相产生偏流;同时要求分离柱支持层下端的死体积尽量小,以防止分离过程中色谱带混合或扩展;分离柱无论大小都必须垂直。以上三点是对分离柱的基本要求。在固定床操作中可以进行正向洗脱,也可以进行逆向洗脱,通常逆向洗脱或再生可得到较好的效果,但对操作要求较为严格。

流态床:料液流动相自柱的下端流入,从上端流出,分离介质在柱内呈流态状,此种分离操作要求严格,一般应用较少。洗脱方式以采用正向洗脱为好。

为了得到高分辨率及高负载量,工作液的制备及性能也是非常重要的因素。工作液的黏度、澄清度等不但影响离子交换剂的分离效果,还影响到分离介质的使用寿命,生化分离往往是一个比较复杂的体系,其中有多种杂质存在,不但有简单的小分子,还有一些胶体物质、脂类物质等。尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆盖了介质的功能基团,或堵塞介质的孔道,造成不可逆污染,缩短介质的使用寿命。在进行分离前,应尽量将工作液进行适当的预处理,以确保分离效果。

蛋白质在分离纯化过程中由于淋洗过程带走目标产物,或因洗脱不完全而使目标产物滞留在介质上,使产物损失。蛋白质的结构变化引起失活,也是影响活性回收的重要因素。近年来，在离子交换过程中加入稳定剂或保护剂不但可以提高收率,还可提高介质对蛋白质的选择性。如在离子交换层析纯化牛血红蛋白的过程中加入作为共溶剂的聚乙二醇(PEG),可以明显地提高回收率,增加介质对蛋白质的选择性,苏志国等对PEG的保护机制进行探讨。由此可见在柱层析过程中加入一些有机高分子物质有利于蛋白质的分离纯化。（后台回复“离子交换”可获得文章下载链接）

离子交换层析操作中流速是影响分离效果的一个重要因素。为了获取优良的分离效果,有的介质提供“建议使用流速”,若未提供此数据,应进行试验,以确立较佳的试验参数。根据离子交换剂的种类、粒径、工作液中有效成分的分子结构等确定流速。对于孔径比较大的介质、分子量相对比较小的目标产物而言,因为有利于传质作用,可采用较高的流速。但对于被分离物质分子相对较小孔径的介质,对生物大分子而言,由于分子扩散速率较慢,不宜采用过快的流速。黏度较大的工作液,因传质速率较低,也应采用较低的流速。但若仅在分离介质的表面进行交换吸附而不扩散到介质的颗粒内部,流速可略快些。使用大孔型离子交换树脂可以适当提高工作液的流速。

流速不但影响交换吸附效果,同样影响洗脱效果,通常洗脱速度比交换吸附的速度要慢些。交换柱流出液中含有的有效成分含量达到10%或20%时,认为分离柱已经失效,工作周期已经结束。这时根据吸附的总量与介质的床体积计算出单位体积介质的负载量,即为工作容量或称动态容量。因此这个数据不是恒量,是根据工作液种类、操作流速、失效终点等多种因素测定的。在讨论工作容量时必须要标明上述各因素,才能成为有效数据。