大家都知道,RNA与蛋白互作这一生物现象中有两个主角,一个主角是RNA,一个主角是蛋白。
先来说一下蛋白,与RNA互作的蛋白被大家统称为RNA结合蛋白RNP,这类蛋白可根据结合RNA的长度不同划分为RNA结合蛋白和微小RNA结合蛋白(如microRNA结合蛋白AGO2)。
RIP 实验流程图
RIP的实验方法是通过特定抗体将蛋白与其结合的RNA捕获,提取RNA进行QPCR或测序检测。
当配角是一般的RNA- mRNA、lncRNA、circRNA,可用特定的蛋白抗体去进行普通RIP即可。
当配角是微小RNA-microRNA时,我们一般用AGO2-RIP,即我们用的特定抗体是AGO2抗体,但要注意的是,并不是所有的microRNA都与AGO2结合,研究者要擦亮眼睛。还有一点值得我们注意的是,一般不会单独研究microRNA,而是研究microRNA与其他RNA的互作。因此我们后续进行QPCR检测时,既要检测microRNA,又要检测与其互作的RNA。
RNA pull down 实验流程图
当主角是RNA时,事情就复杂了一些,但只要理清楚调理,选择合适的研究方法,就会事半功倍。
RNA这个大主角主要分为mRNA、lncRNA、circRNA、microRNA。
RNA pull down的实验方法是通过体外合成生物素标记的RNA探针,去捕获细胞中的RNA结合蛋白,提取蛋白并进行WB或质谱检测。当主角是mRNA、lncRNA时,可通过体外转录方式,合成RNA探针,进行pull down,当主角是microRNA时,我们需要将只有22bp的microRNA进行串联。串联的RNA探针长度约200bp。当主角是circRNA时,我们需要先转录出线性的RNA,用RNA连接酶进行体外成环后,再进行pull down。
由于circRNA成环效率和细胞含量低,RNA pull down一般作为备选方案,现在主流实验方法是类似CHIRP。用circRNA的探针调取内源性的circRNA及蛋白复合物,收集蛋白,进行WB或质谱检测。
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