干货——GST标签蛋白纯化实战经验 3

导读

GST（谷胱甘肽S-转移酶）能特异的与其底物谷胱甘肽结合，根据此原理，融合有GST标签的目的蛋白可以与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异结合，再用酶将GST标签切除，即可得到单纯的目的蛋白。GST融合蛋白纯化具有很多优势，如纯度高、纯化条件温和、蛋白活性不受影响、高可溶性等。

但是此系统也会遇到一些问题，之前我们已经分享了两大类问题，今天分析第三类问题——电泳或者WB检测出现多条带，小伙伴们快来围观吧~

洗脱的蛋白中有杂质 

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       原因：GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

建议：加入蛋白酶抑制剂。出现多条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果。可在裂解溶液中加入1mM PMSF防止目的蛋白降解。一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF，Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC 。注：丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

2

       原因：在宿主细菌中的蛋白降解

建议：多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的。如果是这种情况，需要使用蛋白酶缺陷型菌株（比如lon-或ompT），大肠杆菌BL21随pGEX 载体提供，这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株。

3

       原因：细胞破碎时超声处理过度

建议：降低裂解时间，机械裂解前加入溶菌酶（0.1 倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液，溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0）可能会使结果变好。避免发泡，因为这可能使标签蛋白变性。过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯化。

4

       原因：分子伴侣可能被共纯化了

建议：多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成。这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠。如：DnaK（分子量70kDa）、DnaJ（分子量37kDa）、GrpE（分子量40kDa）GroEL （分子量57kDa）、GroES（分子量10kDa）。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST融合蛋白的方法已经发表。

5

       原因：分子量为70kDa的蛋白与GST标签蛋白共纯化

建议：分子量70kDa的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物，该蛋白参与大肠杆菌中蛋白折叠。有报道说这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4，pH7.4，37°C温浴10分钟而破坏。蛋白样品通过ATP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层析也可以去除DnaK。

6

       原因：抗体和样品中存在的多种大肠杆菌蛋白发生交叉反应

建议：抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应，这取决于抗GST抗体的来源。GST抗体中可能包含一些可以与样品中大肠杆菌蛋白发生交叉反应的抗体。通过与大肠杆菌裂解物的预吸附反应可以除去这些产生交叉反应的抗体。GE的GST抗体即经过此过程，并经WB检测没有非特异性条带。

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GST 标签蛋白纯化填料——不同类型产品满足您的不同需要

GSTrap 4B & Glutathione Sepharose 4B

这款填料所选用的Sepharose 4B基架，是经典的高载量基架，在许多其它填料结合效率不好的实验中，它也能有很好的表现。

GSTrap FF & Glutathione Sepharose 4 FF

FF代表着高流速并且适合后期的工艺放大。但是GST标签蛋白与配基的结合是酶与底物的反应，速度较慢，过高的流速会影响结合效率。

GSTrap HP & Glutathione Sepharose HP

HP填料的平均粒径更小，约为34μm，分辨率更高，使得结合在填料上的蛋白能够被更集中地洗脱下来，所以浓度和纯度更高。但反压也相对较高，适合有ÄKTA设备或者蠕动泵的客户。

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