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一种新型的生物体内蛋白质组学研究方法

来思齐 2018-12-05 15:29:33




动物生长发育依赖于蛋白质在特定组织中表达和这些蛋白质在特定亚细胞结构中的定位。蛋白的组织表达及亚细胞定位,对其功能至关重要。正因如此,已经建立了几个方法研究生物体内蛋白质定位。具体如下:


技术

优点

缺点

荧光蛋白标记

具有较好的空间及时间分辨率。能用于活体动物

转基因动物繁殖率低,检出有限

组织解剖

适用于野生型动物

敏感度不够,仅适用于能够解剖分离的大组织

生物化学分级分离

适用于野生型动物

敏感度不够,仅适用于能够分离纯化的亚细胞组分

非自然氨基酸标记

能在特定细胞中标记整个蛋白质组

需要转基因动物。分辨率较低,不能进行亚细胞定位

限制性酶标记

能在特定细胞中标记整个蛋白质组并进行亚细胞定位

需要转基因动物、H2O2处理并需要使生物素酚接触意向细胞

 

最近,限制性酶标记法得到极大发展。这种方法用大豆抗坏血酸盐过氧化物酶(soybean ascorbate peroxidase ,APX),当存在H2O2及生物素酚时,催化形成激活态酚并与蛋白质形成共价键从而生成生物素标记的蛋白质。然后,生物素标记的蛋白用亲和素进行纯化,进行质谱鉴定。相关研究已经在human cell 及fly tissues中取得成功。作者根据此实验原理,在活动物体内实现了蛋白组定位。

首先,为了研究秀丽隐杆线虫肠道(intestine)组织中蛋白质,作者构建了GFP-APX-NES 、GFP-APX-NLS转基因动物,用肠道特异性spp-5作为启动子,其中NES(nuclear export signal)、NLS(nuclear localization signal)分别表示出核信号及核定位信号,同时,以GFP作为阴性对照。同理地,为研究表皮(epidermi)、体壁肌肉(body wall muscle)、环咽肌(pharyngeal muscle)中蛋白质组,只需要分别用相应的启动子dpy-7、myo-3、myo-2。

当线虫生长到L4期,用H2O2及生物素酚(biotin-phenol)处理,借助荧光显微镜,可以看到线虫体内蛋白质标记情况,结果如下图所示。




最后,用链霉亲和素柱子纯化被生物素标记的蛋白,进行质谱鉴定,便能获得线虫各组织特异性蛋白质组。相关鉴定结果统计如下。





参考文献:

[1] In vivo mapping oftissue- and subcellular-specific proteomes in Caenorhabditis elegans .