串级质谱应用于蛋白质科学研究的实例介绍

1串级质谱用于蛋白质特定氨基酸修饰的研究

1.1 串级质谱用于蛋白质组分析的概述及过程

串级质谱用于蛋白样品的分析时利用了一级质谱与二级质谱联用的分析系统，其中一级质谱通过肽段的质荷比确认目标肽段的相对分子质量，并由二级质谱将多肽片段按照氨基酸逐一打断得到各种离子碎片，并进一步检测质荷比得到肽段的图谱用计算机进行分析（图1）。

图1  串级质谱对特定蛋白质或蛋白质组的分析过程

具体说来，利用串级质谱对蛋白质（组）进行分析起始于蛋白质样品的酶切。为了实现充分酶切，底物蛋白通常需要利用一定浓度的尿素（8 mol/L）或盐酸胍（6 mol/L）进行变性，同时一般会加入5 mmol/L左右的DTT还原蛋白中可能的二硫键。肽段消化酶的种类繁多，酶切过程中对酶的选择也非常重要。由于不同的酶具有不同的特异性，故而需要根据序列进行具体分析。胰蛋白酶（Trypsin）是最常用的水解酶，可以对赖氨酸（K）和精氨酸（R）进行选择性水解。另外实验中还会用到其他种类的蛋白酶，例如谷氨酸C段内切酶（Glu-C）会选择性地对天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）的碳端进行水解。

1.2 串级质谱分析结果与评价参数

由于串级质谱所分析的对象极为复杂，除了目标氨基酸的信号之外，还会有很多背景噪音。如果不借助于计算机分析，利用不断改进的分析方法进行系统性的核查与评估，很难得到准确的肽段信息。

一级质谱对肽段的筛选主要根据相对分子质量的大小来进行。由于质谱仪对目标肽段相对分子质量大小有一定的选择性，通常酶切消化中会将蛋白切成8~20个氨基酸左右大的多肽，从而便于质谱仪筛选。另外，多肽可以同时带有1个以上的电荷，从而降低质荷比，有利于对大肽段的初级筛选。

二级质谱主要通过图谱信息推算氨基酸的序列信息。在大多数情况下，由于氨基酸序列已知，二级质谱的分析主要为data dependent的搜索过程。目前有几种主要的计算机搜索软件，例如SEQUEST，X!Tandem和Mascot等。这些软件所利用的搜索原理和参数略有不同，也各有优劣。本文的质谱数据分析中采用了SEQUEST，因此在此对其进行进一步的阐述。

在基于数据库的分析过程（Data dependent Analysis）中，计算机首先利用特定蛋白酶水解后的肽段信息构建一个理论图谱数据库，由此将实验中得到的实际图谱与理论图谱进行比对，从而计算肽段的匹配度。SEQUEST搜索过程的评分系统主要包含2个参数：cross-correlation (Xcorr)和DeltaCn。简单说来，Xcorr用来评判实际肽段图谱和理论图谱的匹配度^[7]，是一种直接的同时有较高准确度的评判肽段信息的参数。DeltaCn是衡量某肽段最佳匹配的Xcorr值与第二最佳匹配Xcorr值之间的差异，从而对最佳匹配的肽段进行某种程度上的准确度衡量。由此可见，DeltaCn是一种比较粗略的相对评分系统。其他质谱搜索方法对相对评分有所改进，例如X!Tandem将最佳匹配肽段与所有其他的肽段进行比对，从而衡量最佳匹配肽段的准确度，在此不加赘述。

2  特定肽段的检测与图谱计算方法

2.1  肽段二级质谱打断的机制分析

由串级质谱的原理可知，多肽键可能在不同的共价键位置打断形成多种不同组合的离子碎片分子组合。其中能提供氨基酸信息的主要有3种方式，包括C_α—C_C=O打断的a-x模式（图2a），酰胺键C_C=O—N_H打断的b-y模式（图2b），C_α—N_H打断的c-z模式（图2c）。特别地，根据经典共价键理论和键能比较，酰胺键的断裂较C_α—C_C=O共价键或C_α—N_H共价键的断裂容易。故而最易产生的是酰胺键断裂b-y模式，其次是a-x模式。因此在后期搜索中，通常以b-y理论图谱为基础进行搜索^[8]。

图2  以正电荷模式为例，多肽在二级质谱内打断的可能碎片情况（各种离子以共振式表示）

2.2  图谱指认步骤

首先，在匹配的特定肽段的基础上，从C端向N端逐一减少一个氨基酸，编号并计算所得肽段的相对分子质量M（可以使用Chembiodraw或网络程序进行计算）。由于直接计算所得的值包含羧羟基（CO—OH），故而需要在所得值上减去17即得各种b离子的质荷比（M-17）；在所得值上减去2即得各种c离子的质荷比（M-2）；在所得值上减去45即得各种a离子的质荷比（M-45，精确到1个单位）。根据所含氨基酸残基的数目对离子进行编号。

其次，在匹配的特定肽段的基础上，从N端向C端逐一减少一个氨基酸，编号并计算所得肽段的相对分子质量。由于直接计算所得的值包含氨基（—NH₂），故而需要在所得值上加上1即得各种y离子的质荷比；在所得值上减去16即得各种z离子的质荷比；在所得值上加上27即得各种x离子的质荷比。

第三，对于带有翻译后修饰的多肽，根据该氨基酸残基的位置对所得的a、b、c、x、y、z等离子的质荷比进行修改。

第四，对于相对分子质量较大的离子，考虑其可能携带2到3个电荷，对质荷比进行进一步补充。

最后，与串级质谱图谱进行一一比对，实现峰的指认。

本文选取3种典型的模型蛋白，使用串级质谱进行多肽序列分析。其中，泛素蛋白为小相对分子质量的水溶性蛋白；组蛋白H3为小相对分子质量的非水溶性蛋白；绿色荧光蛋白为中等相对分子质量的水溶性蛋白。另外，带有典型翻译后修饰乙酰化的泛素多肽也将作为例子进行分析。

3  实例图谱比

3.1  泛素蛋白

泛素蛋白是具有76个氨基酸序列的小型蛋白，其相对分子质量约为8 500。在实验中使用胰蛋白酶进行酶切，计算机匹配序列为K.IQDKEGIPPDQQR.L，匹配度100%。详细计算如表1所列，对应归属图谱为图3。

表1  泛素蛋白典型肽段图谱计算表

图3  泛素蛋白典型肽段图谱指认与峰的归属

3.2  绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白是一类结构稳定的蛋白，含有230个氨基酸残基。在实验中使用胰蛋白酶进行酶切，计算机匹配序列为M.VSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHK.F，匹配度100%。本肽段为N末端起始序列，且长度为26个氨基酸，故而可能携带多电荷。详细计算过程同3.1，对应主要峰的归属图谱为图4。

图4  绿色荧光蛋白典型肽段图谱指认与峰的归属

 

3.3  人源组蛋白

人源组蛋白是一类重要的染色体组成蛋白，由于其低水溶性，使用大肠杆菌异源表达时存在于包含体中。在实验中使用的内切酶为Glu-C，切割识别位点为带负电荷的D或E，计算机匹配序列为E.AYLVGLFE.D，匹配度91%。计算过程同3.1，对应主要峰的归属图谱为图5。

图5  人源组蛋白典型肽段图谱指认与峰的归属

3.4  蛋白翻译后修饰肽段

为了体现串级质谱对于特定蛋白翻译后修饰的分析功能，特别地选取了一个具有乙酰化赖氨酸的泛素肽段进行分析。计算机匹配序列为MQIFVK(42.0367)TLTGK.T，匹配度100%。详细计算如表2所列，对应归属图谱为图6。

表2  乙酰化泛素蛋白典型含有翻译后修饰肽段的图谱计算表

图6  含有乙酰化泛素蛋白的典型翻译后修饰肽段图谱指认与峰的归属

4  结论

串级质谱分析是近年来迅猛发展的仪器分析技术，在化学和生命科学的相关领域中都起到了很大的作用。特别是在蛋白质（组）科学中，串级质谱可以提供多肽判断和每个氨基酸残基的相关信息，对于翻译后修饰研究是必不可少的技术^[9]。结合蛋白质的化学合成^[10]和生物正交反应^[11]等现代化学生物学技术，蛋白质串级质谱技术可以发现并解决很多过去难以企及的重要蛋白质化学^[12]和生命科学问题^[13]。本文就高校教材与教学中常常被忽略的相关串级质谱知识，以及详细的多肽二级质谱图谱指认和峰归属进行分析讨论。希望对教学和相关研究有助。