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1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。

说明：

(1) Na3VO4要活化：Activation of Sodium Ortho Vanadate

a. Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O。

用ddH2O配制200mM浓度的原矾酸钠(3.68克原矾酸钠加入100ml ddH2O中)

b. Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pH varies depending on the lot of the chemical)。At pH 10.0 the solution is yellow。

以1M NaOH 或1M HCl调整pH值至10.0，此时溶液呈黄色。

c. Boil the solution until it turns colorless (about 10 mins)。

煮沸直至溶液变为无色。

d. Allow solution to cool to room temperature。

冷却至室温。

e.Readjust pH to 10.0 and repeat steps c & d until the soluition remains colorless and the pH stABIlizes at 10.0. Store in aliquots at -20°C。

重调pH值至10.0，重复c、d两步，直到变为无色且pH值稳定至10.0，分装保存在-20°C。

NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, converting it to a more potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J. Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.

(2) 我的配方配的是100ml 细胞裂解液，但如您各个成分的体积加起来，会发现total=102.1ml，那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的。

(3) lysis buffer的使用方法：

a. 细胞用typsine消化下来后，PBS洗2次(1500rpm，离心5min)，然后加适量lysis buffer(1×107个细胞约用200ul，但建议根据自己的实验条件调整ul数，使后来测定的蛋白浓度在5-10ug/ul左右，但不需要太精确)。冰浴30min(中间最好vortex一下)，然后12000rpm，4度，离心15min，取上清，然后进行后继实验如测定蛋白浓度等。

b. 保存在-80℃冰箱可以保证蛋白磷酸化的程度不受影响。提取蛋白时，组织要在液氮中研磨成粉状(研钵也要先在低温下保存，而且要保证研钵周围不挂水珠，这才能真正保证低温。)，将粉末转移到ependoff管中后加适量lysis buffer裂解，之后的处理跟细胞的类似。要特别注意，要让组织保持低温，以保证蛋白不会脱磷酸化。

(4) 把抑制剂配成stock后，再把抑制剂全部加入到裂解液中混合，保存于-20度。

一般配40-50ml，分装成10ml每管，所有试剂都加好的，用时取出，用完再放回-20度冰箱。我使用时没有问题，至少在冰箱中放了两三个月。酶的抑制剂是不太稳定，但我的配方中抑制剂是过量的，所以问题不大。我不采用使用前再加抑制剂是因为避免忘记加抑制剂，或者即使加了抑制剂也容易使实验多一个步骤，容易造成混乱。

2. 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。

3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。

4. 最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。

5. 抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。

6. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。这样才有更强的说服力，可以区分磷酸化水平的增加是因为总的蛋白表达增加，还是因为没有改变总蛋白，只是磷酸化水平增加了。 如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。

补充：

正如我上面所说的，“研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量”。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well中上样两次(可在相同的gel上，也可在不同的gel)，其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量(包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白)，甚至还可跑另一个gel，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去(strip)。

1)Strip Solution(Stripping Buffer，膜再生液)如下:常温密闭保存(有臭鸡蛋味道)，能放很久，几个月不成问题。

2)Strip方法

准备一硬塑料盒，倒入strip solution，将膜完全浸泡(或者将膜与strip buffer封入塑料薄膜中，完全浸入水浴锅中，使四周都能接触恒温水)，50度水浴30min，用TBST洗5分钟，3次即可去除已孵育结合的抗体。信号会均匀地减弱些许，但不会造成差异。

许多人会建议55度水浴30min。Strip solution是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为55度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50度30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55度更能保护蛋白.

3)另外一个Stripping buffer的配方：

4)Strip时一定要注意：

membrane一定要完全泡在strip solution中(可用较硬的塑料膜封好)，然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好，就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张membrane用我提供的方法strip了3次，分别压不同的抗体(因为有时候蛋白分子量很接近)，效果都不错。

7. 做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的band以外，往往会出现非特异性的band。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的band，而没有你想要的band，所以压片以后，你一定要根据markers比对一下，你压出的band分子量是否正确。我以前压WB时，压出了一条band，就以为是我想要的那条，然后还根据趋势推测可能的机制，走了不少冤枉路。还有一次，把markers的分子量记错了，比对出来的结果当然也不对。

8. 磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则backgroud太深，盖住想要的那条band，时间过短则可能没有band或者band太浅。

9. 磷酸化蛋白WB时，用TBST洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可，宁愿background深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。

10. 磷酸化蛋白Western blot高背景的可能原因

(1) 磷酸化蛋白抗体本身特性造成的，这一点除了换抗体，否则无法改善。

(2) Nitrocellulose/PVDF膜质量不高。

(3) ECL荧光发光剂质量不高。

(4) 封闭时要用含5%non-fat milk的TBST，室温1小时，时间不宜过长。

(5) 加入一抗后要4℃过夜。而且一抗要用合适的buffer稀释，一定要根据抗体公司的protocol建议之buffer稀释。就Cell signaling公司的抗体而言，大部分抗体要用含5%BSA的TBST稀释，如改用5%non-fat milk的TBST稀释，除了造成高背景以外，还很容易使抗体不稳定，重复利用的次数会明显下降。当然，Cell signaling公司也有用5%non-fat milk的TBST稀释的抗体，如PARP antibody 。

(6) 另外，还要确定二抗是否合适。比如，用相同的二抗压其它抗体时，是否也有相同的高背景。

磷酸化蛋白检测有几点要注意：磷酸化的时间点确定宜早不宜晚，蛋白提取时要加蛋白酶抑制剂，封闭液得用BSA而不是脱脂牛奶，为了实验进程，不要对蛋白进行冻融，有时，用更强的显色液ECL有利于磷酸化程度弱的蛋白显色。

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